作者丨雪岳CRISPR筛选是发现基因功能的强大工具。 对同一基因的不同等位基因的研究可以为蛋白质结构和功能机制提供独特的见解。 碱基编辑技术是一种基于CRISPR的技术，在向导sgRNA中引入特异性突变，无需双链断裂或同源修复，适用于等位基因功能的大规模筛选，并可实现单核苷酸分离。 T细胞是免疫的重要靶点，但免疫有很大的局限性，很多患者对它没有反应，因此迫切需要新的方法来分析关键基因中的特定核苷酸序列，发现新的功能基因。 碱基编辑已用于 T 细胞的多次敲除，降低染色体易位的风险，并已应用于 CAR T 细胞产品。 使用高通量突变筛选平台可以揭示 T 细胞等位基因谱，可用于发现更多靶基因以提高免疫力**。 近日，来自加州大学旧金山分校alexander marson团队在nature发表于题为base-editing mutagenesis maps alleles to tune human t cell functions品。 研究新开发的碱基编辑系统用于筛选原代T细胞中等位基因的功能，为免疫提供了新的工具**。 
为了在人原代T细胞中实现碱基编辑器的高通量使用，作者优化了腺嘌呤碱基编辑器ABE8E（V106W）（缩写为ABE）和胞嘧啶碱基编辑器EVOCDA1-BE4MAX（缩写为CBE）的慢病毒递送系统。 总的来说，作者设计了一个包含117,000个sgRNA的文库，这些sgRNA分布在与细胞活力相关的385个基因的编码区中，以识别与细胞活化相关的突变。 作者评估了sgRNA的编辑效率，并将增强细胞活化的sgRNA定义为阳性，将抑制细胞活化反应的sgRNA定义为阴性。 作者从筛选中选择了功能性sgRNA对应靶标的子集。 分析发现，该系统能够识别已知与细胞活化相关的突变。 接下来，作者分析了 dgkz、LCP2、PIK3CD、PLCG1 和 V**1 的阳性和阴性 sgRNA，系统筛选了这些 sgRNA，以分析不同等位基因的不同功能。 作者验证了这些筛选结果，发现 DGKZ、LCP2、PIK3CD、PLCG1 和 V**1 的阳性和阴性 sgRNA 分别促进或抑制细胞毒性功能。 据报道，作者筛选的PIK3CD中两个等位基因突变的功能是原代T细胞中的免疫致病突变，这进一步证实了作者使用的系统可用于筛选功能等位基因。 作者还评估了筛选的功能数据与已知蛋白质结构之间的关系。 分析发现，PIK3CD中的获得性功能突变可导致3D口袋结构被具体地组合在一起。 Pik3CD与PI3K的PIK3R1调控亚基共结晶，作者也对其进行了筛选和鉴定。 针对 PIK3R1 位点的碱基编辑可以增加细胞 TNF、IL2 和 IFN 的产生。 这也表明，碱基编辑诱变可以提供有关原代人 T 细胞蛋白质结构中关键残基和结构域的信息，包括蛋白质-蛋白质相互作用位点。 该研究表明，碱基编辑诱变可以加深对分子功能的理解，促进工程蛋白和RNA的发育，为免疫力的发展提供变革性工具**。 原文链接：
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