说到DLL3，每个人都会想到ROVA-T，这种ADC药物让艾伯维对DLL3的58亿美元预期感到失望。 艾伯维的倒闭也让DLL3靶向**的热度一度下降，但安进在2023年ESMO上发布的DLL3 CD3双特异性抗体tarlatamab数据令人瞩目。 同年12月13日，安进公司还宣布，FDA的tarlatamab的BLA申请已被受理并被授予优先审评权。 消息一经发布，针对 DLL3** 的热度持续上升。 那么 DLL3 到底是什么？ 目前，还有哪些制药公司已经布局了针对DLL3的最佳管线？
Delta-like ligand 3 （DLL3） 是 delta 样配体 （DLLS） 家族的成员。 DLLS 是一种附着在细胞表面的单次跨膜蛋白，除了 DLL3 之外，该家族还有两个成员，DLL1 和 DLL4。 编码 DLL1、DLL3 和 DLL4 的基因分别位于 6 号染色体上2 和 15Q151 在 [1] 上。 人DLL3蛋白由619个氨基酸组成，其特征是由40个氨基酸、6个EGF样重复序列和跨膜结构域组成的N端保守DSL（delta、锯齿、lag2）结构域，其中SDL结构域在配体家族中高度保守，是与Notch受体结合的基本结构。 如图 1 所示，DLL1 和 DLL4 有 8 个 EGF 样重复序列，DLL1 和 DLL4 在 C 末端也有一个 PDZ 结合基序，这是 DLL3 所缺乏的 [2]。 DLL3在进化过程中高度保守，人和小鼠DLL3蛋白序列的同源性可以达到82%。
figure 1. the structure of dlls [1]
DLL3 RNA主要在大脑、内分泌组织和血液中表达。 DLL3 在正常组织中几乎不表达。 发现 DLL3 在大约 80% 的小细胞肺癌 （SCLC） 和其他神经内分泌肿瘤中高表达。 DLL3 在正常细胞和肿瘤细胞中的差异表达使其成为有吸引力的肿瘤选择性靶标。
DLL3是Notch信号通路的抑制性配体[3]，在Notch信号传导中起关键作用。 Notch通路是一种高度保守的细胞间信号通路，涉及多个生长发育过程，如多能祖细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖和细胞边界的形成。
通常，Notch信号通路通过局部细胞间相互作用调节细胞命运。 哺乳动物中有四种 NOTCH 受体（NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4）和五种 NOTCH 配体（DLL 和 Jagged 1 2）。 Notch受体被高尔基体中的弗林蛋白酶（S1裂解）切割成2个片段，并转运到细胞表面形成跨膜异二聚体。 当与邻近细胞上的Notch配体相互作用时，Notch受体再经历两次切割，首先是ADam1017催化细胞外膜附近的肽键切割（S2切割），然后是靠近细胞内膜的分泌酶复合物（S3裂解）的裂解，从而释放Notch细胞内结构域（NICD）。 然后释放的 nicd 进入细胞核并与 DNA 结合蛋白 CSL （CBF-1） 结合形成 NICD CSL 转录激活复合物。 然后，该复合物募集MAML（Mastermind-likeProtein）并激活转录切迹靶向的基因，包括HES、HEY和HERP等转录抑制因子家族[4] [5]。
在高尔基体中用 O-岩藻糖修饰 DLL，以在运输到细胞膜之前增加或减少 DLL-Notch 信号传导。 细胞膜上的DLL与EGF结合后，它通过内吞作用顺势激活Notch信号。 然后，内吞的DLL被蛋白酶或溶酶体降解，或在循环后被转运到细胞膜表面。 内吞作用后 DLL 的降解或回收由泛素化的 DLL 胞内结构域 （DICD） 控制。 除了激活NOTCH信号外，DLLS还可以通过多种方式抑制NOTCH信号。
figure 2. notch ligands and notch signaling [6]
回到 DLL3，与其他哺乳动物 NOTCH 家族成员不同，DLL3 在正常发育过程中定位于高尔基体和细胞质囊泡，与未加工的全长 NOTCH1 和 DLL1 相互作用，阻止它们定位在细胞表面，从而抑制 NOTCH 信号传导。
小细胞肺癌（SCLC）是一种低分化的神经内分泌肿瘤，是最具侵袭性的肺癌类型，SCLC的进展与Notch信号通路密切相关，Notch信号通路调节正常发育所需的许多基本过程，该通路失活突变可诱导非神经内分泌肿瘤细胞或肿瘤前体细胞的神经内分泌分化。 DLL3 是 Notch 信号通路的唯一抑制性配体，在 85% 的 SCLC 中高表达，但在正常肺组织中不高表达。 这些结果表明，DLL3可能参与神经内分泌肿瘤发生，但其作用机制尚不清楚。 此外，DLL3 是 achaete-scute 同源物 1 （ASCL1） 的下游靶标，在神经内分泌细胞分化和 SCLC 生长中起关键作用。 在一项研究中，Furuta M等[7]证明DLL3过表达促进了SCLC细胞的生长，并增强了其迁移和侵袭的能力。 邓等人还发现，DLL3通过促进Akt蛋白磷酸化和抑制Notch受体来促进小鼠肿瘤生长，并通过促进细胞增殖和减少小鼠Lewis肺癌（LLC）细胞凋亡来抑制Notch受体[8]。
除SCLC外，DLL3在大细胞神经内分泌肺癌（LCNEC）、某些其他神经内分泌癌和前列腺癌的细胞表面也高度上调和异常表达，使其成为潜在的靶点。
目前，共有16个DLL3靶向项目，其中15个处于临床阶段，1个处于临床前阶段。 **各不相同，包括抗体-药物偶联物 （ADC）、CAR-T 和抗体药物。
4.1 dll3-adc
rova-tRovalpituzumab tesirine，全称rovalpituzumab tesirine，是一种靶向DLL3的ADC药物。 该ADC最初由Stemcentrx开发，艾伯维于2016年以58亿美元的预付款收购了该公司，然后继续进行ROVA-T的临床开发。 最新的进展是终止开发，针对SCLC的适应症。 ROVA-T 是一种 DLL3 特异性人源化单克隆抗体，通过可裂解的二肽接头偶联吡咯二嗪 （PBD） 二聚体毒素。 ROVA-T 通过与细胞表面 DLL3 结合触发受体介导的内吞作用。 内吞作用导致 rova-t-DLL3 复合物内化到细胞中，然后与溶酶体融合。 ROVA-T的缬氨酸-丙氨酸连接子被溶酶体相关组织蛋白酶裂解，PBD从复合物中释放到细胞质中。 然后，细胞质中的PDB进入细胞核，以位点特异性方式插入DNA之间，引起DNA损伤，并最终通过细胞凋亡诱导细胞死亡[9]。
figure 3. mechanism of action of rova-t [10]
ROVA-T已经进行了至少10项临床试验，包括两项3期临床试验。 2016 年，ROVA-T 的首次人体研究在二线和三线** SCLC 患者中产生了 18% 的客观缓解率 （ORR） 和 36% 的 1 年生存率。 基于这一结果，艾伯维直接跳过了II期临床研究，进行了III期研究，但不幸的是，这两项III期研究都因未达到预先设定的PFS和/或OS中期主要终点而提前终止。 基于对结果和其他因素的分析，艾伯维宣布中断ROVA-T的开发。
fz-ad005这是复旦张江第三款采用Linker-Drug平台（BB05平台）的下一代ADC产品。 该ADC产品通过BB05与重组人鼠嵌合抗DLL3单克隆抗体和拓扑异构酶I抑制剂偶联，于2023年12月22日获批临床试验，拟用于晚期实体瘤，包括但不限于小细胞肺癌、大细胞神经内分泌癌、前列腺癌等。
yl212ZL-1310，又称ZL-1310，是伊联生物拥有自主知识产权的谭林科技平台研发的DLL3 ADC产品。 Tmalin平台是一种新型抗体-药物偶联平台技术，其特点是利用肿瘤微环境来克服当前ADC药物的挑战。 与传统的细胞内裂解不同，YL212具有细胞外和细胞内裂解的双重机制，是基于新型ADC技术的候选分子。 2023年4月27日，再鼎医药与亿联生物就YL212达成战略合作及全球许可协议。 2023年12月1日，CDE正式宣布再鼎医药注射用ZL-1310临床申请获理。 目前正处于癌症适应症的I期临床试验中。
4.2 DLL3双特异性抗体
amg 757，又称tarlatamab，是安进公司开发的一种靶向DLL3和CD3的双特异性抗体。 2023年12月，BLA申请获得FDA受理，并被授予治疗二线小细胞肺癌的优先审评资格，有望成为全球首个CD3 DLL3双特异性抗体。 Tarlatamab 是一种双特异性 T 细胞接合器 （TCE），对肿瘤细胞上的 DLL3 和 T 细胞上的 CD3 具有双重亲和力。 这种双重结合将肿瘤细胞与自体 T 细胞结合，触发免疫突触的形成和 T 细胞活化，并启动以 CD3 聚集、T 细胞增殖以及多孔性颗粒酶和穿孔素释放为特征的多克隆 T 细胞反应。 这一系列事件最终导致肿瘤细胞凋亡和 T 细胞反应的扩增。
tarlatamab 分子由两个单链可变片段 （SCFV） 组成，包括一个稳定、无效应子的功能性 FC 结构域，以增加半衰期。 目前，有六项正在进行的临床研究评估tarlatamab。
figure 4. the structure of action of tarlatamab [10]
qls31904齐鲁药业自主研发的是一种靶向DLL3 CD3的TCE双特异性抗体。 该药物包括一个抗 DLL3 特异性 Fab 片段、一个抗 CD3 SCFV 片段和一个修饰的 Fc 区以支持异二聚体。 目前处于临床I期，拟用于小细胞肺癌等晚期实体瘤。
figure 5. the structure of action of qls31904 [10]
bi764532由勃林格殷格翰开发，也是一种TCE双特异性抗体，具有靶向DLL3 CD3的IgG骨架。 2023 年 10 月，BI 764532获得 FDA 的快速通道资格，** 用于广泛期小细胞肺癌 （SCLC） 和晚期或转移性肺外神经内分泌癌 （NEC）。 目前，BI764532正在临床试验中。
figure 6. the structure of action of bi764532 [10]
pt-217由 Phanes Therapeutics 开发的是一种双特异性抗体，具有靶向 DLL3 和 CD47 的天然 IgG 结构。 PT217可以通过巨噬细胞的ADCP活性和NK细胞的ADCC活性直接杀伤肿瘤细胞，同时靶向肿瘤细胞表面过表达的DLL3和CD47，扩大肿瘤杀伤范围。 此外，PT217有望通过将肿瘤细胞引导至吞噬抗原呈递细胞（APCs）来诱导肿瘤新抗原呈递，并通过识别肿瘤新抗原间接激活DLL3表达低或无DLL3表达的肿瘤细胞的T细胞杀伤，从而刺激适应性免疫系统。 PT217 的抗 CD47 单臂高度分化，临床前模型显示可保持对肿瘤细胞的强 CD47 结合活性，同时与人红细胞的结合最小。
PT217于2022年获美国食品药品监督管理局（FDA）批准在美国进行多中心I期试验（临床注册号NCT05652686），并于2022年获得FDA孤儿药认定，用于治疗**小细胞肺癌。
4.3 DLL3 三抗
hpn328是 Harpoon 使用其专有的三特异性 T 细胞活化构建体 （TriTAC） 平台构建的三特异性抗体，由三个人源化抗体衍生结构域组成：在肿瘤细胞上结合 DLL3 的 N 端结构域、结合人血清白蛋白的中间结构域（用于延长半衰期）和结合 CD3 的 C 端结构域。 HPN328目前正处于1 2期临床试验中，以评估HPN328作为单一疗法**在携带DLL3表达的晚期癌症患者中的安全性、耐受性和药代动力学。 2024年1月9日，默沙东（MSD）宣布将投资约6以 8 亿美元收购 Harpoon Therapeutics。 从那时起，默克公司将开发一系列T细胞接合剂**，包括HPN328，以扩大其肿瘤学产品线。
figure 7. the structure of action of hpn328 [10]
zg006由 Zelgen Pharmaceuticals 开发的是一种针对 CD3 和两种不同 DLL3 表位 （CD3 DLL3 DLL3） 的三特异性抗体。 临床前研究表明，ZG006在小鼠肿瘤模型中具有显著的肿瘤抑制作用，导致小鼠肿瘤完全消退。 在非人灵长类动物中，ZG006表现出低毒等良好的安全性特征。 目前，ZG006正处于SCLC适应症的1-2期临床试验中。
4.4 dll3 car-t
amg 119，一种由安进开发的 CAR-T 细胞**，包括一个编码抗 DLL3 的结构域、一个 CD28 和 4-1BB 共刺激结构域以及一个 CD3 细胞内结构域。 2019年12月，该药物被FDA授予孤儿药资格。 2023年9月，AMG119在小细胞肺癌患者中的临床**特征和药代动力学特征发表在《临床药理学杂志》上，结果显示AMG119表现出较强的细胞扩增能力、良好的细胞持久性和良好的反应性，在试验剂量下临床安全且耐受性良好，无剂量限制性毒性（DLT）。 目前，该药物正处于I期临床试验阶段。
allo-213，是Allogene开发的一种靶向DLL3的同种异体CAR-T，尚未启动临床试验。
lb-2102是南京传奇研发的靶向DLL3双表位的CAR-T**LB2102，利用VHH抗体技术和“武装”CAR-T技术克服肿瘤微环境抑制因子。 它携带两个可识别 DLL3 的 VHH 抗体片段和一个可被肿瘤微环境中的信号激活的跨膜蛋白。 2023年6月，FDA授予其孤儿药资格，用于**SCLC。 同年11月，诺华与传奇生物签署了LB2102的全球独家许可协议。
4.5 dll3 car-nk
dll3 car-nk cells是天津市肿瘤医院开发的DLL3 CAR-NK**，包括抗DLL3 SCFV结构域、NKG2D跨膜结构域和2B4-CD3结构域，目前正在招募针对**难治性ES-SCLC患者的I期临床试验。
DMA Biotechnology是一家专注于可成药靶点的临床前研发产品和服务的生物技术公司。 DMA 现在为 DLL3 靶标提供全方位的产品和服务。 产品包括活性蛋白、参比抗体和防流单克隆抗体; 服务包括多属蛋白的抗体定制、抗体人源化和亲和力成熟服务。 此外，为了加速DLL3生物**的开发，迪马还准备了DLL3靶点单B细胞种子库，最快28天即可获得先导抗体分子; 同时，迪马还对部分现有的DLL3先导抗体分子进行了CAR-T或ADC分子构建和功能验证，帮助您更快地开发DLL3药物。
重组活性蛋白
human dll3 protein, hfc tag (pme100607)
figure 8. the validated data of pme100607. the purity of the protein is greater than 80% as determined by sds-page and coomassie blue staining (left). elisa plate pre-coated by 2 μg/ml (100 μl/well) human dll3 protein, hfc tag (pme100607) can bind anti-dll3(rovalpituzumab biosimilar) mab (bme100068) in a linear range of 0.64–80 ng/ml (right).
参比抗体
anti-dll3(rovalpituzumab biosimilar) mab (bme100068)
单克隆抗体的流式细胞术验证
anti-dll3 antibody(67e6), igg1 chimeric mab (dmc101089)
参考资料： 1] Steinbuck MP， Winandy S a review of notch processing with new insights into ligand-independent notch signaling in t-cells. front immunol. 2018 jun 1;9:1230.
2]ascano jm, beverly lj, capobianco aj. the c-terminal pdz-ligand of jagged1 is essential for cellular transformation. j biol chem. 2003 mar 7;278(10):8771-9.
3]ladi e, nichols jt, ge w, et al. the divergent dsl ligand dll3 does not activate notch signaling but cell autonomously attenuates signaling induced by other dsl ligands. j cell biol. 2005 sep 12;170(6):983-92.
4]wang mm. notch signaling and notch signaling modifiers. int j biochem cell biol. 2011;43(11):1550–1562.
5]d’souza b, miyamoto a, weinmaster g. the many facets of notch ligands. oncogene. 2008;27(38):5148–5167.
6]xiu mx, liu ym, kuang bh. the role of dlls in cancer: a novel therapeutic target. onco targets ther. 2020 may 7;13:3881-3901.
7]furuta m, kikuchi h, shoji t, et al. dll 3 regulates the migration and invasion of small cell lung cancer by modulating snail. cancer science. 2019 may;110(5):1599-608.
8]deng s m, yan x c, liang l, et al. the notch ligand delta-like 3promotes tumor growth and inhibits notch signaling in lung cancercells in mice[ j]. biochemical and biophysical research communi-cations，2017，483(1):488-494.
9]saunders lr, bankovich aj, anderson wc, et al. a dll3-targeted antibody-drug conjugate eradicates high-grade pulmonary neuroendocrine tumor-initiating cells in vivo. sci transl med. 2015 aug 26;7(302):302ra136.
rudin cm, reck m, johnson ml, blackhall f, hann cl, yang jc, bailis jm, bebb g, goldrick a, umejiego j, paz-ares l. emerging therapies targeting the delta-like ligand 3 (dll3) in small cell lung cancer. j hematol oncol. 2023 jun 24;16(1):66.