中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
sn/t 5649-2023
呋喃丹和动物源性食品中的代谢物羟基硫丹残留物的测定
液相色谱质谱质谱
determination of carbofuran and its metabolites residues 3-hydroxycarbofuran in foods of animal origin—lc-ms/ms method
以前的话
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本文件主要起草人：习静、李菊、李天勇、曹晓刚、徐娟、司璐璐、宋伟、吴淑岳。
范围
本文件规定了测定动物源性食品中呋喃丹和代谢物3-羟基呋喃丹残留物的液相色谱-质谱法。
本文件适用于动物组织、鸡蛋、牛奶、蜂蜜、蜂王浆、蜂胶和肠衣中呋喃丹残留物和代谢物3-羟基呋喃丹的测定。
规范性参考文献
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GB T 6682 分析实验室用水规范和试验方法。
术语和定义
本文档中没有需要定义的术语和定义。
操作方法摘要
用乙腈提取样品中残留的呋喃丹和3-羟基呋喃丹，分散固相萃取纯化，液相色谱-质谱检测，外标法定量。
试剂和材料
除另有说明外，所用试剂为分析纯度，试验用水应符合GB T 6682规定的一级水。
5.1 乙腈：色谱纯。
5.2 甲醇：色谱纯度。
5.3 甲酸：色谱纯度。
5.4 氢氧化钙。
5.5 无水硫酸镁：在500马弗炉中烘烤约4h，冷却后存放在密闭容器中备用。
5.6 氯化钠。
5.7 柠檬酸钠二水合物。
5.8 柠檬酸二钠-倍半水合物。
5.9 甲酸铵：高级纯度。
5.10 5 MMOLL L 甲酸铵-01%甲酸水溶液：称取0314 5 g甲酸铵在小烧杯中，加少量水溶解后转移至1 000ml容量瓶中，精密加甲酸1ml，用水稀释至刻度，混匀。
5.11 0.5%氢氧化钙溶液：称取5g氢氧化钙，充分溶解并用水稀释至1 000ml，滤过滤液，准备立即使用。
5.12克百威参考物质（C12H15NO3，CAS号1563-66-2）：纯度98%。
5.13 3-羟基克卡硫丹参考物质（C12H15NO4，CAS号16655-82-6）：纯度98%。
5.14克百威标准储备溶液，1 000毫克升。 精密称取呋喃丹标准品10mg，加少量甲醇溶解，转移至10ml容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，-18避光保存，保质期为6个月。
5.15 3-羟克羧化物标准储备液，1 000 mg l。 精密称取3-羟克克卡硫丹标准品10mg，加少量甲醇溶解后，转移至10ml容量瓶中，用乙腈定容，摇匀，-18避光保存，保质期为6个月。
5.16.混合标准中间溶液：测量1ml标准储备溶液（5。14 对 515）、用乙腈稀释，定型至10ml，与浓度等于100的标准中间体溶液混合0 mg L，-18 避光储存，保质期为 1 个月。
5.17.混合标准工作溶液：准确量量混合适量的标准中间溶液（516） 空白基质稀释至 0001 mg/l、0.002 mg/l、0.005 mg/l、0.010 mg/l、0.020 mg/l、0.050 mg l 和 0100 mg L 标准工作溶液，浓度为一系列，即用型。
乙 二 胺-n-丙基硅烷基化硅胶（psa）：粒径m~60m
十八烷基硅烷键合硅胶（c18）：粒径m~60m
5.20 微孔膜： 022 m，有机相。
仪器设备
6.1.液相色谱-质谱质谱：配备电喷雾离子源（ESI）。
6.2.电子天平：电感为001 g 和 01 mg。
6.3 组织泥瓦匠。
6.4 均质机：10 000 r/min.
6.5个振动台。
6.6 涡旋混合器。
6.7支移液器：100 L 1 000 L。
6.8.离心机：4 000转以上
6.9 高速冷冻离心机：12 000 rmin.
6.10 超声波清洗机。
6.11 吹氮器。
标本的制备和保存
7.1 牛肉、鸡肉、猪肝、罗非鱼、鸡蛋、猪油。
取样品中具有代表性的可食用部分500克，用纸巾母制成品捣碎，充分混合，放入干净的容器中。 密封并标记并储存在-18以下。
7.2 蜂蜜。
取代表性试样500 g，搅拌均匀，对于有结晶沉淀的样品，将试样置于密闭状态下不超过60°C的水浴中，待试样全部熔化后搅拌均匀，迅速冷却至室温。 融化时，应注意防止水分挥发，并将其放入干净的容器中。 密封并标记好，并在室温下避光储存。
7.3 牛奶，蜂王浆。
取代表性样品500克，搅拌均匀，放入干净的容器中，密封并标记，并储存在-18以下。
7.4 蜂胶。
取代表性样品500克，冷冻-20年，然后在纸巾母中捣碎，充分混合，放入干净的容器中。 密封并标记并储存在-18以下。
7.5 猪肠衣。
取500克代表性样品，用剪刀剪成5毫米或更小的长度，用纸巾母捣碎，充分混合，放入干净的容器中。 密封并标记并储存在-18以下。
检测步骤
8.1 样品提取。
8.1.1 牛肉、鸡肉、罗非鱼。
称取 5 g 试样（精确到 0.）。01 g）置于50 ml离心管中，加入乙腈10 ml，用均质机以10 000 r min匀浆20 s 30 s，然后取10 ml乙腈清洗均质机刀头上的残渣，混合乙腈提取物后，在涡旋混合器中混合提取20 s 30 s， 和4g无水硫酸镁，1g氯化钠，1g柠檬酸钠二水合物，05g柠檬酸二钠-倍半水合物，充分混合，置振荡萃取中10分钟，以4 000r min离心5分钟，取出1ml上清液纯化。
8.1.2 猪肝、牛奶、猪油和猪肠衣。
称取 5 g 试样（精确到 0.）。01g）在50ml离心管中，加入10ml乙腈，涡旋混合并充分混合20秒30秒，加入4 g无水硫酸镁1 g氯化钠1 g柠檬酸钠二水合物0.5 g柠檬酸二钠盐倍半水合物混合后，放入振荡器中10分钟，以4 000 r分钟离心5分钟，取出1ml上清液进行纯化（猪脂肪提取上清液在-18下冷冻1小时，除去冷冻脂肪）。
8.1.3个鸡蛋，蜂蜜，蜂王浆。
称取 5 克鸡蛋、2 克蜂蜜和蜂王浆（精确到 0.）。01g），放入50ml离心管中，加入5ml水，涡旋混合器混合1分钟，静置5分钟。 加入乙腈10ml，涡旋混合1分钟，在振荡器上提取10分钟，加入2g和3g氯化钠涡旋混合1分钟，以4 000r分钟离心5分钟，取出1ml上清液进行纯化。
8.1.4 蜂胶。
权重 02 g 试样（精确到 0.）。001g）在50ml离心管中，加入10ml乙腈，涡旋混合1分钟，置超声清洗器提取10分钟，加入10ml05%Ca（OH）2水溶液，涡旋混匀2min，然后加入4g 6g氯化钠，涡旋混合2 min，在0条件下以10 000r min离心10 min，取4ml上清液纯化。
8.2 净化。
8.2.1 牛肉、鸡肉、罗非鱼、猪肝、牛奶、猪油、猪肠衣、鸡蛋、蜂蜜、蜂王浆。
拿1.3.将待净化的液体分别转移到内容物中150 mg无水硫酸镁50 mg psa跟50 mg c18塑料离心管，涡旋并充分混合1分钟，以12 000r min离心5分钟，取上清液超过0用于LC-MS质谱的22 M有机相微孔膜。
8.2.2 蜂胶。
拿 81.4.将所有待纯液体转移到装有除水剂和纯化物料（每ml待纯溶液150mg无水硫酸镁、50mg PSA和50mg C18）的塑料离心管中，涡旋混合，然后以12 000 rmin离心5 min。 精密地将2ml上清液移入氮气吹管中，加入1ml乙腈，在45水浴中吹氮后立即复溶至干燥，涡旋并充分混合用于LC-MS质谱的22 M有机相微孔膜。
8.3 空白基质提取物。
通过进行试验确定没有被测成分的试样，并将试样压成 81 和 82 次操作得到空白基质提取物。
8.4 测定。
8.4.1 液相色谱条件。
由于测试结果取决于所使用的仪器，因此无法给出液相色谱分析的一般参数。 设定的参数应保证在色谱分析时，被测组分能与其他组分有效分离，并给出以下参数供参考。
LC参考条件如下：
a） 列：c18列150 mm2.1 mm（内径）、粒径m或同等学历;
b）流动相：a：甲醇;B：5 mmoll 甲酸铵-01%甲酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表1;
c） 流量：03 ml/min；
d） 注射量：2 l;
e） 柱温：45;
8.4.2 质谱条件。
质谱条件如下：
a） 电离方式：电喷雾电离（ESI）;
b） 护套气 （kpa）： 24132；
c） 辅助气体 （kpa）： 6895；
d） 吹扫气体 （kpa）： 689；
e） 离子传输管温度 （ ） 350;
f） 蒸发温度 （ ） 300;
g） 扫描方式：正离子;
h）监测方式：多反应监测法（MRM）;
i） 定量和定性离子对以及碰撞能 （EV） 如表 2 所示。
8.4.3 绘制标准工作曲线。
按照 8 取空白样品1 和 82 处理。 在所得样品溶液中，将呋喃丹和3-羟基呋喃与标准中间溶液（516）注入稀释制得的混合标准工作液，按浓度从低到高的顺序进行检测，以定量离子峰面积为纵坐标，以标准工作液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。
8.4.4 定性测定。
关注 84.1 和 84.2.如果待测物质在样品中的保留时间与标准工作溶液一致，则保留时间偏差为2在5%以内，且定性离子对的相对丰度（表示为强度相对于最强离子丰度的百分比）与浓度相当的标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度的允许偏差不超过表3的规定，各离子的信噪比为3， 然后可以判断样品中的相应分析物。
8.4.5 定量测定。
对于标准工作溶液和样品溶液的相同体积注射测定，待供试样品溶液中呋喃丹和3-羟基呋喃丹的响应值应在标准曲线的线性范围内，如果超过线性范围，应在注射分析前稀释。 关于呋喃丹和3-羟基硫丹物质的信息见表A1.呋喃丹和3-羟基呋喃的多反应监测色谱图见图B1 和图 b2。
8.5 空白测试。
除非称量样品外，均遵循上述步骤。
计算结果和演示
采用外标法定量，用色谱数据处理软件或按式（1）计算样品中呋喃丹和3-羟基呋喃丹的残留量，从计算结果中扣除空白值。
式中：x——样品中呋喃丹和3-羟基呋喃丹残留物的量，单位为毫克/千克（mg kg）;
c - 从标准工作曲线获得的样品溶液中测量组分的浓度，单位为微克/毫升（g ml）;
v - 样品溶液的最终体积，单位为毫升（ml）;
m - 最终样品溶液所代表的样品质量，单位为克 （g）。
呋喃丹残留物在GB 2763中定义为呋喃丹和3-羟基呋喃丹的总和，以呋喃丹表示。 因此，根据公式（2）计算样品中呋喃丹的总残留量：
其中：x总计 - 样品中的总残留物，以呋喃丹克数克表示，单位为毫克/千克（mg kg）;
X克呋喃丹 - 样品中呋喃丹残留的量，单位为毫克/公斤（mg kg）;
x3-羟基呋喃丹 - 样品中3-羟基呋喃丹的残留量，单位为毫克/千克（mg kg）;
0.93 – 3-羟基呋喃丹与呋喃丹的系数。
计算结果保留两个有效数字，当含量超过1 mg kg时保留三个有效数字。
定量限
牛奶中呋喃丹和呋喃丹3-羟基呋喃丹的定量限为0001 mg/kg；蜂胶中呋喃丹和呋喃丹3-羟基呋喃的定量限为005 mg/kg；牛肉、鸡肉、肝脏、罗非鱼、鸡蛋、蜂蜜、蜂王浆、脂肪和肠衣中呋喃丹和呋喃丹3-羟基硫丹的定量限值为001 mg/kg。
11 **速率和精度。
该方法对牛肉、鸡肉、猪肝、罗非鱼、鸡蛋、蜂蜜、蜂王浆、蜂胶、牛奶、猪油和猪肠衣基质进行了测试，不同基质中不同添加水平下**率的数据和精密度见附录C表C1。
*从：