文章介绍
2024年1月24日，荷兰研究学者在《华尔街日报》上advanced healthcare materials（if:9.9995）发表了一篇题为“使用乐高类积木的模块化微流体类器官平台”的研究文章。
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总结。 abstract
鉴于目前3D体外模型的局限性，有必要补充：类器官和器官芯片 （OOC）。技术正在融合。 然而，将类器官掺入标准OOC的过程面临许多技术挑战，例如繁琐的处理、缺乏灵活性，并可能导致复杂和低效的细胞培养方案。 因此，开发专门适配且更灵活的微流控平台有助于实现复杂3D体外模型的高效集成。 本研究开发了一种模块化、无管流体电路板（FCB）与可逆封装细胞培养砖相结合，用于胚胎干细胞（ESC）来源的甲状腺滤泡的动态培养。 甲状腺类器官在几分钟内成功转移到芯片上并培养了 10 天，同时在使用 6 个 FCB 的多重灌注实验中保持其结构和功能，验证了该系统是一个灵活且易于使用的平台，可将类器官与先进的微流体技术紧密集成。
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研究方法： methods
本文的研究方法主要基于：模块化微流控系统，使用类似于乐高积木构建微流控芯片，实现类器官的培养和研究。
具体来说，研究人员首先设计和制造了不同类型的模块化组件，包括细胞培养室、微流体通道、阀门和泵。 然后，这些组件可以以简单的方式组装，以构建不同的微流控芯片，以适应不同类型的类器官和实验需求。 FCB 是通过在聚碳酸酯 （PC） 板上铣削一个通道，然后用另一块 PC 板热压而形成的。 类似乐高的流体连接器允许在各种细胞培养砖和 FCB 之间实现即插即用连接。 锁定和播放 （LNP） 夹子集成到类器官块中，以方便（卸载）加载类器官。
在制造出微流控芯片后，研究人员使用这些芯片来生长和研究不同类型的类器官，包括肝脏、肺、肾脏和甲状腺等。 在培养过程中，研究人员可以使用微流控系统来控制细胞的生长环境，包括温度、氧气浓度、营养物质和药物。 此外，微流控系统可用于收集和分析细胞培养基中的代谢物和分泌物，以评估类器官的功能和反应。
除了使用微流控系统培养和研究类器官外，研究人员还使用了多种分析方法来评估微流控芯片的性能和类器官的功能。 这些方法包括细胞活力分析、免疫染色和共聚焦显微镜成像。 通过这些方法，研究人员可以评估微流控芯片的可行性和效率，并确定其在类器官研究中的应用潜力。
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主要结果。 results
1. 设计
微流控系统由一个无管流体电路板组成，该电路板可以通过新型流体互连连接到类似乐高的细胞培养模块块。 电路板尺寸为39x137mm，由两层PC组成，顶层为流体界面，底层为微流体通道。 这些通道通过热压接闭合。 该系统允许细胞培养基质在模块的砖块之间循环，形成一个单一的微流控平台。 模块砖的通用尺寸为38x38mm，高度因功能而异，从15-30mm不等。 不同微流控通道布局的底板可以粘接在顶板上，这样模块砖可以多种方式配置，增加系统的通用性。 有两个示例系统，一个由带有OOC砖和罐砖的流体电路板组成，另一个由两个带有OOC砖的罐砖组合成一个单独的流体室。 所有板均通过标准鲁尔型 I-O 端口连接到外部泵，最多可并联安装 6 个用于细胞培养，总容量约为 1 个3升。 所有组分均可灭菌并重复用于多种培养实验。
图1 这是一个用于动态培养类器官模型的模块化微流控平台。 （A）FCB和细胞培养砖的3D设计概念。 在FCB中即插即用地插入积木是通过乐高启发的流体连接器实现的。 （b） FCB由顶层PC层（具有流体界面）与底层热粘合，底层刻有通道。 底层可以根据需要进行定制，以创建不同的流体通路。 （c） 不同底部FCB层中不同流体路径的示意图。 FCB** 带有储液罐和 OOC 砖，** 注入红色和蓝色食用色素。 多孔膜载体可以集成在OOC设备中，用于各种研究，例如跨生物屏障的跨上皮转运和细胞迁移测定，以及生物活性因子梯度的研究。 （D） 和 （e） 细胞培养实验前后的 6 个 FCB**。
2. 制作 FCB
本研究中FCB（流体电路板）的制造涉及多个步骤。 首先，使用 SOLIDWORKS 软件对 FCB 设计进行建模，并使用 VisualCAM 软件将其转换为 G 代码文件。 然后使用CNC铣床制造FCB，从而可以快速准确地加工具有不同槽形的PC板。 底部 FCB 层加工成各种槽槽几何形状和尺寸，从 03 比 10毫米。 FCB的顶层由带有流体界面的PC层组成。 加工成功后，通过液压机将底部的FCB板与上部的FCB板一起热压在一起，并由聚合物胶膜介导。 优化键合温度，避免通道变形和泄漏。 最后，将粘合的FCB板灌注荧光素染料以测试泄漏。 FCB制造工艺经过优化，可实现可靠、无泄漏的微流体通道密封。
图2 微铣流体通道和PC-PC FCB板的热压粘接。 （a） ** 具有划线流体路径的 PC 试样（宽度 = 1 mm，高度 = 0.）。5mm）。右侧是具有不同几何形状（圆形、正方形和三角形）的通道横截面的光学激光图像。 比例尺，500μm。 （b） 划定通道的地形分析。 划线通道的大小由光学轮廓仪（Keyence VK-X100K）量化。 （c） 在不同的主轴转速和进给率下铣削测试槽时，表面粗糙度 （RA） 的量化（平均标准偏差）。 数据来自三个铣削副本 （n=3），每个点表示样品表面积上多条线 RA 测量值的平均值。 （d） 确定微通道的范围和毛刺形成的光学**。 图像以 10 倍放大倍率拍摄。 比例尺，250μm。 （e） 用于粘接两块FCB板的系统装置（铝，铝）示意图。 f） 用荧光素染料灌注并在不同键合温度下预键合的闭合通道的荧光图像。每个键合温度下的荧光强度（au.，任意单位）如下。对于每个图像，绘制三条垂直于通道长度的线并等距。 （g） FCB样品**的封闭通道。 i） 在 120 °C 和 140 °C 下粘合的两个通道横截面的体视显微镜图像。 比例尺，500μm。 （j） 在不同粘接温度下粘接的通道高度和宽度的变化。 所有数据均采用Kruskal-Wallis检验具有统计学意义。 ns， 非显著性; p>0.5；*p<0.1；**p<0.01。数据来自两个独立的粘合剂样品（n=12）的四个通道横截面的三次测量。
3.即插即用流体互联
在模块化微流控平台上，通过使用FCB的圆形凹槽（孔）和类似于乐高积木的底部（塞子）来实现即插即用的流体互连。 插头和凹槽同轴对齐，并具有输入输出 （I-O） 孔，允许液体在模块化砖和 FCB 之间流动。 I-O 端口的尺寸和几何形状是可调节的，以确保毛细管力在与 FCB 断开后将液体保持在模块化砖内。 此外，在每个安装O形圈的塞子中都创建了一个径向凹槽，以便在与FCB凹槽壁接触时形成密封。 O型圈槽是预润滑的，槽的角是倒角的，以避免损坏密封件。 确定适当的间隙和 O 形圈压缩对于在模块化砖和 FCB 之间建立可靠且可逆的密封至关重要，从而实现系统的快速组装和拆卸。 即插即用的流体互连旨在在模块化砖和 FCB 之间提供简单且可逆的连接，便于系统的快速组装和拆卸。
图3 乐高式流体界面的发展。 （a） ** 包含四个螺栓的模块化砖的底部。 螺栓彼此之间等距，类似于市售乐高积木的螺栓。 （b） 流体界面的3D模型。 将模块化砖插入 FCB 的圆形凹槽中。 O形圈径向放置在螺栓上。 通过集中和对齐的微通道，实现了模块化砖和FCB之间的流体连接。 （c） O型圈失效情况图示。 高间隙和低压缩会导致泄漏，而过度压缩会导致 O 形圈被夹住和损坏。 （d） 最大爆破压力值的量化，因为螺栓是由3D打印树脂（MED610TM）或机加工的PC（平均S.）制成的。e.m） 密封强度的量度。（e） 将模块化砖插入 FCB 中，并在 05ml min-1 速率灌注**。 f） 由 3D 打印材料和机加工 PC 制成的 O 形圈螺栓成功插入的百分比。（g） 3D打印和加工的PC螺栓的侧壁和O形圈槽，带和不带O形圈**。 比例尺，15mm。（h） 用于PC螺栓3D打印和加工的O形圈凹槽表面的3D热图。 （j） 3D打印和机加工螺栓表面精度的测量（平均s.）e.m）。
4. 模块模块和LNP OOC
模块化砖块和LNP（锁定-**OOC（器官芯片））是模块化微流控平台的关键组件。 模块模块设计用于执行各种功能，包括细胞培养基罐、pH 和氧传感器模块以及可逆封装的 OOC。 这些砖具有相同的外部尺寸和四螺钉连接器布局，便于与 FCB 连接。 所有模块化砖的流体通道都由一组由 PDMS 铸件制成的特定流体层定义，这允许在多个灭菌周期后保持透明度、易于清洁和厚度保持。
LNP 夹子被提议用作紧固件，以促进类器官快速轻松地加载和卸载到微流控 OOC 中。 这种方法结合了新型无内胎 FCB 和带有可逆 LNP 密封件的 OOC 模块砖，可直接进入电池室。 FCB 允许通过乐高式流体接口将各种细胞培养砖直接连接到 FCB，无需管路和侧面固件，而 LNP 密封有助于在 OOC 砖中培养类器官。 这种协作方法减少了手动组装操作的时间和复杂性，最终促进了功能类器官在芯片上的集成。 该平台已通过在芯片上保护甲状腺类器官的结构和功能进行了验证，展示了其在高级类器官应用方面的潜力。
图4 细胞培养模块模块和LNP芯片设备的开发。 （a） 器官芯片、细胞培养基罐模块、用于连续测量溶解氧和 pH 值的传感器模块以及小型显微镜的 3D 模型视图。 （b） LNP器官芯片装置的3D**模型视图。 该器件由一个 PC 外壳（灰色）、一个流体芯片（青色）和一个热成型薄膜载体（黄色）组成。 载体可以用镊子轻松移入和移出芯片。 用 4 倍放大倍率拍摄的明场**显示了在膜载体中培养的 MatrigelTM 包埋的小鼠 ESC 衍生的甲状腺类器官。 比例尺，250μm。 （c） 夹紧和未夹紧的器官芯片**。 d） 器官芯片器件流体路径的 3D 视图。（e） 从LNP芯片器官装置的被动气泡捕获盒的延时记录中提取的静止图像。 设备以 0 开头以5ml min-1的速率灌注蓝色食用色素。
5. FCB平台用于类器官培养的验证
FCB平台已通过类器官培养验证，特别是MatrigelTM包埋的甲状腺类器官。 该平台允许这些类器官在静态条件下在微热成型载体中预成型和培养三天。 该验证证明了FCB平台适用于类器官培养，解决了以前与芯片类器官培养相关的挑战。 该平台的设计，包括使用模块砖和LNP夹子，促进了类器官在微流体环境中的培养，降低了手动组装操作的复杂性，并使功能类器官能够集成在芯片上。 验证还证实了芯片上甲状腺类器官的结构和功能的保留。
图5 为类器官培养开发的微流控平台的验证。 （a） 实验装置**，第 0 天。 FCBS 与 6 个储液罐、6 个 OOC 模块模块和 1 个传感器模块模块模块连接，用于监测 DO2 和 pH 值。 （b） 第 3 天灌注时大多数 OOC 模块砖的俯视图。 一些气泡被困在气泡陷阱中。 （c） 第10天的侧视图。 **流体界面处无泄漏。 （d） 传感器模块砖的底视图。 黄色箭头表示流经气泡阱、pH传感器点（白色）和最后通过黑点（DO2）的方向。 （e） 连续测量氧气和pH值。 （f） 在流动或静态孔中暴露于 3 天和 10 天的甲状腺类器官培养物。 绿色是由TG启动子驱动的GFP。 明场图像以 4 倍放大倍率拍摄。 比例尺，150μm。 在具有静态对照的 OOC 模块砖中培养的类器官的活死染色荧光图像。 红色是用乙锭同源二聚体-1 （ethD） 染色的死细胞。 比例尺，250μm。 （g） 甲状腺类器官的等效直径测量值。 所有数据均表示为平均值 （n=35），并使用 Kruskal-Wallis 检验进行统计学显着性检验。 ns， 非显著性; p>0.05。（H） 在 OOC 模块砖中培养 3 天的甲状腺类器官的共聚焦 Z 投影。 用GFP（绿色）标记、TG（红色）、ZO-1（白色）染色和DAPI（蓝色）复染的类器官的免疫荧光图像。 图像以 25 倍放大倍率拍摄。 比例尺，100 μm和插图，25 μm。
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总结。 suggestion
本研究描述了用于 3D 类器官培养的模块化微流控平台的开发。 该平台由无管流体电路板 （FCB） 和可逆封装的细胞培养块组成，包括器官芯片 （OOCS） 和传感器模块。 FCB是通过在聚碳酸酯（PC）板材中铣削一个通道，然后用另一块PC板热压而成的。 乐高式流体连接器允许在细胞培养积木和 FCB 之间实现即插即用连接。 LNP 夹子集成到 OOC 块中，以方便类器官的加载和卸载。 该平台已通过MatrigelTM包埋甲状腺类器官的培养验证，证明了其适用于类器官培养，并有可能应用于先进的类器官应用。 平台的模块化设计和不同模块之间使用相同的流体界面有助于新组件的设计过程，使其适用于FCB。 该平台的设计降低了手动组装操作的复杂性，最终促进了功能类器官与芯片的集成。 因此，本研究为下一代微生理系统的开发提供了创新和有价值的解决方案。
引用。 a modular microfluidic organoid platform using lego® -like bricks.adv healthc mater. 2024 jan 21:e2303444. doi: 10.1002/adhm.202303444.pmid: 38247306.
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