蛋白磷酸化检测技术

蛋白质磷酸化是细胞内重要的信号转导机制，参与许多细胞功能，如生长、死亡和反应。 磷酸化蛋白在细胞信号传导中起关键作用。 因此，研究蛋白质磷酸化对于了解细胞生物学和疾病进展非常重要。

图1酸化定量蛋白质组学分析工作流程。

蛋白质磷酸化的测定通常使用以下方法进行：

1.放射性标记方法：

-32P ATP 通常用作放射性磷酸盐供体，在蛋白激酶的催化下，使目标蛋白磷酸化。 然后，通过辐射测定法检测蛋白质磷酸化水平。

2、western blotting：

使用对特定磷酸化位点具有特异性的抗体进行检测。 首先，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，然后转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，然后用特异性磷酸化抗体进行检测。

图2远西印迹分析。

3.质谱：

蛋白质或肽的质谱分析可以精确测定蛋白质磷酸化的位点和程度。 常用的技术包括液相色谱串联质谱（LC-MS）。

4. Phos-tag凝胶电泳：

phos-tag 是一种与磷酸化位点结合的化合物。 在磷酸标签 SDS-PAGE 中，磷酸化蛋白在凝胶中的移动速度更慢，与非磷酸化蛋白分离。

5. ELISA（酶联免疫吸附测定）：

使用磷酸化特异性抗体，可以构建 ELISA 实验以确定样品中磷酸化蛋白的水平。

6.流式细胞仪：

磷特异性抗体和荧光标记使流式细胞术能够在单细胞水平上分析蛋白质磷酸化。

在选择蛋白质磷酸化测定方法时，应考虑样品的性质、所需的灵敏度和分辨率、可用的仪器以及实验的预期目标。