从历史上看，用于识别神经激活的最广泛使用的分子标记是即刻早期基因 （IEG），例如 FOS。 然而，没有可比的分子标志物可用于识别神经活动减少。 蛋白质翻译后修饰 （PTM），例如磷酸化，受细胞活性的快速和双向调节，并具有作为细胞活性“开关”标志物的分子基础。
2024年1月17日，美国斯克里普斯研究所的研究人员发表了神经科学领域的顶级期刊neuron(if:16.2）发表了题为“Phosphorylation of pyruvate dehydrogenase inversely-associates with neuronal activity”的论文。在这项研究中，使用光遗传学技术+磷酸化蛋白质组学来发现一种不同的标志物，可以灵敏地标记神经活动的下降 - PPDH（磷酸化丙酮酸脱氢酶），它与先前指示神经活动增加的标志物不同。 这种逆向活动标记 （IAM） 可以与 IEG 或其他标记结合使用，以描述和识别由经验或行为引起的双向神经动力学。
研究材料
光遗传学技术诱导的低活性和高活性的初级皮层神经元;
小鼠模型（麻醉、化学遗传学、视觉刺激、缺水-饮用、禁食-再喂养）。
技术路线
第一步：建立基于光遗传学技术的神经元激活平台;
步骤2：磷酸化蛋白质组结果显示，磷酸化PDH（PPDH）与神经活动呈负相关。
第 3 步：在原代细胞中，PPDH 与神经活动动态相关;
第 4 步：在体内，PPDH 与实验诱导的神经活动抑制相关;
第 5 步：PPDH 与感官体验诱导的神经活动呈负相关;
第 6 步：PPDH 和即刻早期基因 （IEG） 联合指示内在状态诱导的神经激活和抑制;
第 7 步：PPDH 揭示了与下丘脑外侧摄食行为相关的细胞型神经动力学。
发现：
1.建立基于光遗传学技术的神经元激活平台
研究人员在原代皮层神经元上表达光敏通道蛋白（ChannelRhodopsin-2（CHR2），以建立基于光遗传学技术的神经元激活平台。 光刺激产生大量具有同步、精确放电模式的神经元。 在 10 cm2 区域，10 ms、5 mW mm2 470 nm 光刺激足以激发高达 10 Hz 的动作电位，同时获得超过 106 个具有同步动作电位的神经元。 这些激活的神经元具有直接早期基因 （IEG） 的 mRNA 表达显着升高，例如 FOS、ARC 和 NPAs4。
图1 光遗传学技术获得具有同步和精确放电模式的神经元。
2.磷酸化蛋白质组学检测显示，磷酸化PDH（PPDH）与神经活动呈负相关
研究者向动作电位发射 0对 5 Hz（慢速、低活性）和 10 Hz（快速、高活性）神经元进行磷酸化蛋白质组检测，共检测到 7543 个磷酸化肽和约 50 个显著差异化的磷酸化肽。 选择两个下调磷酸化位点PDH E1亚基1A、Ser293和Ser300（PDH1A，简称PPDH）作为后续研究的靶点。
PDHA1A 是丙酮酸脱氢酶复合物 （PDC） 中的一种限速酶，可控制丙酮酸进入三羧酸氧化物循环 （TCA）。 TCA的激活已被证明是神经元放电所必需的。 PDH的磷酸化抑制酶活性，而其去磷酸化激活PDH，进而产生更多的ATP。 这一结论与研究人员的发现一致，即当神经元高速放电（高活性）时，PPDH显着下调。 研究人员认为，当神经元高度活跃时，PDH被去磷酸化，增加ATP的产生，以满足神经元的高能量需求。 基于这种功能相关性和商业单克隆抗体的易得性，研究人员决定测试 PPDH 是否可以用作反向活性标志物 （IAM）。
图2 磷酸化蛋白质组学分析显示PPDH与神经活性呈负相关。
3.在原代细胞中，PPDH与神经活动动态相关
在原代神经元中同时检测到 PDH Ser293 和 Ser300 的磷酸化。 研究人员继续检查这两个位点在小鼠不同大脑区域的磷酸化，发现PSE293 PDH是体内的主要形式。 因此，研究人员将重点放在PSER293 PDH。
在5 Hz连续光遗传学刺激的条件下，研究人员检测到PPDH低于10 Hz。 停用 50 分钟后，PPDH 恢复到与基线相当的水平。 药理抑制后，PPDH升高，加入KCL后逆转。 以上结果显示：PPDH可以是双向的，并受神经元活动的反向调节。
图3 体外PPDH与神经元活性呈负相关。
4.在体内，PPDH与实验诱导的神经活性抑制有关
然后，研究人员测试了PPDH是否可以用作体内神经活动的组织学标志物。 研究人员首先测量了异氟烷麻醉引起的神经活性抑制后的 PPDH 水平。 结果显示，2小时的麻醉导致大脑区域广泛的FOS免疫荧光信号丢失，而研究人员检测到多个大脑区域的PPDH显着上调。 与早先的报道一致，研究人员还发现，麻醉导致视上核中的FOS显着升高，而在该区域的一组离散神经元中检测到高PPDH。 此外，并非所有区域都存在高 PPDH，例如海马体的 CA3 区域、外血脑屏障 （BBB），并且 PPDH 对异氟烷麻醉无反应。 因此，与即刻早期基因 （IEG） 一样，PPDH 标记具有区域偏好、偏倚和差异。 有趣的是，在很早的时候（麻醉后1小时），可以在大脑区域检测到强烈的PPDH，而FOS的缺失并不明显这反映了这样一个事实，即与直接早期基因 （IEG） 的表达相比，PPDH 具有更快的动态特性。
图 4-1 PPDH 与麻醉中的神经活动呈负相关。
此外，研究人员还发现，PPDH可以标记被化学遗传学等常见电路操作技术沉默的神经元。
图 4-2 PPDH 与化学遗传学诱导的神经活动呈负相关。
5.PPDH与感觉体验诱导的神经活动呈负相关
研究人员继续采用小鼠视觉刺激方案来检测视觉通路中 PPDH 的动态变化。 首先将小鼠保持在黑暗中48小时（视觉剥夺），然后暴露于明亮的视觉刺激4小时以诱导神经元活动，然后再次回到黑暗中2小时和12小时（此时视觉刺激诱导的活动有望消退）。 与文献报道一致，初级视觉皮层（V1）、膝状外侧核（LGN）和边缘内嗅皮层（LENT）中的FOS信号在4 h时被视觉刺激强烈诱导，并在2 h后缓慢恢复到基线水平。 相反，在小鼠重新进入黑暗环境2小时后，所有三个区域的PPDH信号都显示出急剧增加，表明：视觉刺激的停止（从而减少视觉通路的激活）可以被PPDH迅速捕获。 基于细胞标记物染色，发现大多数PPDH标记的细胞是neun+神经元。
图5 PPDH与视觉刺激中的神经活动呈负相关。
6.PPDH 和即刻早期基因 （IEG） 的组合表明内在状态诱导的神经激活和抑制
研究人员继续使用小鼠水剥夺 （WD） 和饮用水模型来检测 MEPO（正中对视核）中 PPDH 的变化，MEPO 是水稳态的关键区域，以确认 PPDH 是否可以标记行为或内在状态诱导的神经活动。 在水重新可用之前，将小鼠剥夺水24小时。 结果表明：缺水后MEPO区FOS显著升高，恢复饮水1 h后PPDH显著升高，饮用8 h后FOS缓慢恢复到基线水平，再次反映了PPDH与FOS标志物在非动力学方面的差异。
接下来，研究人员测量了缺水下全脑区域的FOS和PPDH水平。 结果显示，在FOS高表达的最初几个大脑区域，PPDH显著降低，这表明：PPDH可以标记与FOS相反方向的神经活动变化。 研究人员开发了用于 PPDH 免疫染色的抗体和操作方法，并且：在10多个大脑区域中，PPDH的显著降低可以观察到缺水的显着变化，但FOS染色的变化则不然，这表明可以通过结合 PPDH 和即时早期基因 （IEG） 来发现一些新的神经底物。
图6-1 在缺水模型中，PPDH与神经活动呈负相关。
此外，该研究还发现，在禁食和再喂食的小鼠模型中，禁食后的ARC区域显示出显著增加的FOS信号和降低的PPDH信号。 然而，在重新喂养1小时后，未检测到FOS信号的降低，但可以检测到PPDH信号的强烈升高。 综上所述，这些数据表明：PPDH提供了一种以前未能用现有的基于IEG的活动标志物组织学标记神经元抑制的方法，并直接证明了使用PPDH跟踪体内神经元活性降低的可行性。
图6-2 在食物剥夺模型中，PPDH与神经活动呈负相关。
7.PPDH揭示了与下丘脑外侧摄食行为相关的细胞型神经动力学
即刻早期基因（IEGs）已被证明是研究不同大脑区域和神经元类型对各种刺激的反应的有力工具。 研究人员继续测试PPDH是否有能力揭示研究较少的大脑区域或细胞类型的动力学。
在禁食-再喂养实验中，下丘脑外侧区（LH）的一组离散神经元在禁食后表现出显著且特异性的PPDH降低，然后在重新喂食后迅速恢复表达，表明这组神经元被禁食激活，被再喂食抑制。 然而，这种抑制不能通过对 FOS 或其他直接早期基因 （IEG） 的免疫染色检测到。 研究人员使用PPDH的多种标记物和其他组织学标记物来发现该区域的细胞类型。 最终发现PPDH+神经元与下丘脑分泌素高度重合，但与MCH或VGAT神经元不重合。 这种由禁食-再喂养诱导的细胞类型特异性抑制在HCRT-CRE小鼠中得到验证，并且与最近关于饮食期间下丘脑分泌素食欲素神经元失活的报道一致。 因此PPDH 可作为标记物来表征特定的下丘脑分泌素食欲素 LH 细胞群，该细胞群通过禁食激活，但通过再进食迅速抑制。
图7 PPDH揭示了与下丘脑外侧摄食行为相关的细胞类型神经动力学。
总结
综上所述，本研究采用光遗传学技术+磷酸化蛋白质组学筛选，结果显示丙酮酸脱氢酶E1亚基1（PPDH）的磷酸化与体外和体内培养的神经元的动作电位放电强度呈负相关，即与神经元活性呈负相关。 研究者认证PPDH 可靠地反映了一系列环境中神经元活动的减少，从而将 PPDH 确定为内源性反活动 （IAM） 的第一个可追溯标志物。 在未来，PPDH染色可以与全脑透明、成像或扫描工具相结合，以改变我们理解活动双向变化的能力，以更精细的方式研究神经元细胞群，并揭示既定和新范式背后的神经回路。
推荐人：钟科友品
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