中华人民共和国国家标准
gb 31658.20-2022
食品安全国家标准
动物性食品中酰胺醇及其代谢物残留的测定
液相色谱串联质谱
national food safety standard-
determination of amphenicols and metabolite residues in animal
derived food by liquid chromatography-tandem mass spectrometry method
范围
本文件规定了用于测定动物性食品中酰胺类酒精药物及其代谢物残留的样品制备和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、鸡、牛、羊肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织以及鸡蛋、牛奶和山羊奶中氯霉素、硫霉素、氟苯尼考和氟苯尼考酰胺残留的测定。
规范性参考文献
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GB T 6682 分析实验室用水规范和试验方法。
术语和定义
本文档中没有需要定义的术语和定义。
原则
用2%氨化乙酸乙酯溶液提取样品中残留的氯霉素、硫霉素、氟苯尼考和氟苯尼考酰胺，经正己烷脱脂，氨化乙酸乙酯反萃提取，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。
试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯水，水为符合GB T 6682的1级水。
5.1 试剂。
5.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。
5. 1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5. 1.3氨（NH3·H2O）。
5. 1.4乙酸乙酯（C4H8O2）。
5.1.5 无水硫酸钠（Na2SO4）。
5.1.6 氯化钠 （NaCl）。
5.1.7 甲酸铵 （HCOONH4）。
5.1.8 正己烷（C6H14）。
5.2.溶液制备。
5.2.1 2%氨化乙酸乙酯溶液：取氨水20ml，用乙酸乙酯稀释至1 000ml。
5.2.2 4%氯化钠溶液：取氯化钠4g，溶于水中，稀释至100ml。
5.2.3 4%氯化钠饱和正己烷：取4%氯化钠溶液适量，加过量正己烷，混合，静置分层，取上层正己烷。
5.2.4 20%甲醇溶液：取甲醇20ml，用水稀释至100ml。
5.2.5 10 mmol L甲酸铵溶液：取甲酸铵063 g，溶于水并稀释至1 000 ml。
5.3 标准。
氯霉素、硫霉素、氟苯尼考和氟苯尼考酰胺均为99%，氯霉素-d5、硫霉素-d3、氟苯尼考-d3和氟苯尼考酰胺-d3均为98%，详见附录A。
5.4.标准溶液的制备。
5.4.1.标准贮液：取氯霉素、硫霉素、氟苯尼考和氟苯尼考酰胺标准品适量（相当于各有效成分约10mg），精密称定，加甲醇适量溶解稀释置100ml容量瓶中，配制浓度为100ml的标准储备液，浓度为100ml。 -18 以下内容将保留 12 个月。
5.4.2.内标原液：取氯霉素-d5、硫霉素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯可拉胺-d3内标适量（相当于各有效成分约1mg），精密称定，加甲醇适量溶解稀释置10ml容量瓶中，配制浓度为100 g ml的内标储备液。 -18 以下内容将保留 12 个月。
5.4.3.混合标准中间溶液：01ml，美太霉素、氟苯尼考和氟苯可拉胺标准储备溶液各0ml在10ml容量瓶中5ml，用甲醇稀释至刻度，制备浓度为1g ml氯霉素和浓度为5g ml硫虫素，氟苯尼考和氟苯可拉胺的混合标准中间溶液。 -18 以下内容将保存 3 个月。
5.4.4.混合内标中间溶液：01 ml，美太霉素-D3、氟苯尼考-D3 和氟苯尼考拉胺-D3 内标原液各 0 个5ml，在10ml容量瓶中用甲醇稀释至刻度，用浓度为1g ml的氯霉素-D5和浓度为5g ml的硫霉素-D3、氟苯尼考-D3和氟苯胺-D3制备混合内标中间体。 -18 以下内容将保存 3 个月。
5.4.5.混合内标工作液：取混合的内标中间溶液，用20%甲醇溶液稀释成浓度为10 ng ml的氯霉素-d5，以及浓度为50 ng ml的磺霉素-d3、氟苯尼考-d3、氟苯蔻胺混合内标工作液，即取，即取。
5.5 材料。
尼龙微孔膜：m
仪器设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：功率分布喷雾离子源 （ESI）。
6.2 平衡：电感 00001 g 和 001 g。
6.3 均质机。
6.4.涡旋混合器。
6.5.多管涡旋振荡器。
6.6 高速冷冻离心机：最高 8 000 转/分
6.7.吹氮器。
标本的制备和保存
7.1.样品的制备。
7.1.1肌肉、肝脏、肾脏和脂肪组织。
取适量的新鲜或解冻的空白或测试组织，将其切碎，并匀浆。
a） 取均质化后的试样作为试样;
b）取均质后的空白试样作为空白试样;
c）取均质的空白试样，加入适当浓度的标准工作溶液，作为空白试样使用。
7.1.2 牛奶。
取适量的新鲜或解冻的空白或测试牛奶或山羊奶，搅拌均匀。
a） 取混合均匀后的试样作为试样;
b）混合均匀后取空白样品，作为空白样品;
c）取均质的空白试样，加入适当浓度的标准工作溶液，作为空白试样使用。
7.1.3个鸡蛋。
取适量的新鲜或冷藏的空白或试蛋，去壳，匀浆。
a） 取均质化后的试样作为试样;
b）取均质后的空白试样作为空白试样;
c）取均质的空白试样，加入适当浓度的标准工作溶液，作为空白试样使用。
7.2.样品的保存。
18 保存在下面。
检测步骤
8.1 提取。
取 2 g 样品（精确到 0.）。05 g），置50ml离心管中，加混合内标工作液100 l，涡旋混匀，再加入2%氨化乙酸乙酯溶液10ml（牛奶和山羊奶样品中应加入3g无水硫酸钠），涡旋30 s，涡旋10 min， 并以8 000 r分钟离心5分钟。 将上清液转移到另一个50ml离心管中，向残留物中加入10ml 2%氨化乙酸乙酯溶液，重复提取一次。 将两种提取物合并，在50°C氮气中干燥，并纯化。
8.2 净化。
取待纯化的残渣，加4%氯化钠溶液3ml，涡旋溶解，再加4%氯化钠饱和的正己烷5ml，涡旋30s，8 000 rmin离心5 min，弃去上层正己烷层，用4%氯化钠饱和的正己烷重复脱脂。 加入5ml 2%氨化乙酸乙酯溶液，涡旋5分钟，以8 000r分钟离心5分钟，取上层有机相。 用5ml 2%氨化乙酸乙酯溶液重复提取一次，合并有机相，用50氮气吹干，加入20%甲醇溶液10 ml，涡旋 30 秒，超过 0用于液相色谱串联质谱的 22 m 滤膜。
8.3.标准曲线的准备。
精密量取混合标准中间体溶液与混合内标工作液适量，用20%甲醇溶液稀释，配制浓度为0的氯霉素2 μg/l、0.5 g l、1 g l、2 g l、5 g l、10 g l、硫霉素、氟苯尼考和氟苯尼考的浓度分别为1 g l和25 g L、5 g L、10 g L、25 g L、50 g L，氯霉素-D5浓度为1 g L，硫霉素-D3、氟苯尼考-D3、氟苯尼考酰胺-D3浓度为5 g L，准备进行液相色谱串联质谱测定。 以定量离子峰面积比为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。
8.4 测定。
8.4.1 液相色谱参考条件。
a） 列：c18列 （100 mm2.1 mmm或同等学历;
b） 柱温：30;
c） 注射量：5 l;
d） 流量：03 ml/min；
e）流动相：a为10mmoll甲酸铵溶液;b为乙腈; 梯度洗脱程序如表1所示。
8.4.2质谱参考条件。
a） 离子源：电喷雾离子源;
b）扫描方式：正离子扫描、负离子扫描;
c）检测方法：多反应离子监测（MRM）;
d） 脱溶剂气、锥形气体和碰撞气体均为高纯氮气或其他适宜气体;
e） 喷雾电压和碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度;
f） 分析物离子源、定性离子对、定量离子对、锥体电压和碰撞能量的参考值见表2。
8.4.3 测定。
8.4.3.1.定性测定。
在相同试验条件下，酰胺醇及其代谢物在试样溶液中的保留时间与酰胺醇及其代谢物在标准工作溶液中的保留时间的相对偏差为25%，并且检测到的相对离子丰度应与可比浓度的校准标准溶液的相对离子丰度一致。 允许偏差应符合表3的要求。
8.4.3.2 定量测定。
将供试品溶液与相应的标准溶液在单点或多点进行校准，按内标法按色谱峰面积比定量。 酰胺醇及其代谢物与标准溶液和样品溶液中相应内标峰面积的比值应在仪器的线性范围内。 对于超出仪器线性范围的残留物，根据提取时药物浓度相应增加内标工作液的加入量，使供试品溶液稀释后的酰胺醇及其代谢物浓度在曲线范围内，相应的内标浓度与标准工作溶液一致。 标准溶液的特征离子质量色谱图见附录B。
8.5 空白测试。
取空白样品，除不添加药物外，使用完全相同的测定步骤进行测定。
结果的计算和呈现
根据标准曲线或式（1）计算样品中酰胺醇及其代谢物的残留量。
其中：x-样品中酰胺类酒精药物及其代谢物的残留值，单位为微克/千克（g kg）;
CIS - 样品溶液中酰胺醇及其代谢物的内标浓度值，单位为微克/升（g l）;
CS - 标准溶液中酰胺醇及其代谢物的浓度，单位为微克/升（g L）;
c'是 - 标准溶液中酰胺醇及其代谢物的内标浓度值，单位为微克/升（g l）;
AI - 样品溶液中酰胺醇及其代谢物的峰面积;
AIS——酰胺醇及其代谢物在试样溶液中内标的峰面积;
AS - 标准溶液中酰胺醇及其代谢物的峰面积;
a'是——标准溶液中酰胺醇及其代谢物内标的峰面积;
v - 溶解残渣的20%甲醇溶液的体积值，单位为毫升（ml）;
m – 试样质量的数值，单位为克 （g）。
方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度。
该方法中氯霉素的检出限为01 g kg，定量限为02 μg/kg；硫菌素、氟苯尼考和氟苯尼考酰胺的检出限为05 g kg，定量限为 1 g kg。
10.2 准确性。
这种方法氯霉素在02 g kg、1 g kg、1 g kg、1 g kg、100 g kg、氟苯尼考和酰胺在1 g kg、6 000 g kg、**加成浓度、70%、120%的加成浓度水平。
10.3 精度。
该方法的相对标准偏差在测定内为15%，测定之间的相对标准偏差为20%。
*从：