来自华南理工大学、暨南大学和华中科技大学等高校的研究人员在iScience上发表了一项名为“CRISPR Activation Screening in a Mouse Model for Drivers of Hepatocellular Carcinoma Growth and Metastasis”的研究，该研究被用于该研究CRISPR 激活 （CRISPRA） SAM2 慢病毒文库筛选肝细胞癌的全基因组生长和转移驱动因素，为肝肿瘤侵袭转移相关功能基因的体内筛选提供了路线图。
原发性肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤，其中肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，占所有病例的90%。 在这项研究中，研究人员通过：crispra对原发性肝肿瘤生长转移过程中的功能获得性筛选进行系统表型测量，鉴定候选靶点Xage1B、PLK4、LMO1和MyADML2促进细胞增殖和侵袭
在8个独立的感染重复实验中，研究人员使用了：crispr/cas9 sam2 pooled library转导HEPG2细胞，体外培养43106细胞1周后移植至免疫功能低下的BLABC Nu Nu小鼠肝脏中构建原位肿瘤模型，筛选小鼠模型进行功能增益转移。 结果显示，SAM2文库转导小鼠的体重和存活率均低于对照组，在宏观观察下，SAM2文库转导和未转导的HEPG2细胞在注射部位形成肿瘤。 此外，SAM2转导小鼠肝脏VEGF、波形蛋白和MMP9蛋白表达水平显著升高，SAM2转导小鼠肺中VEGF和MMP9蛋白表达水平升高。 这些结果表明，SAM2文库转导增强了HEPG2细胞在肺部形成转移的能力。
图1 从SAM2文库移植的HEPG2细胞肿瘤的生长和转移。
研究人员将肝脏和肺基因组中的sgRNA序列进行PCR扩增，通过高通量测序计算了sgRNA在细胞中的覆盖率，并比较了肺和肝脏之间的归一化sgRNA丰度差异。 结果显示，H基因中sgRNAs的丰度在肺中高于肝脏，肝脏是肺转移的特异性基因C型基因可能促进肿瘤生长和肺转移;L型基因sgRNA的丰度低于肝脏，可能主要促进肿瘤生长而不是转移。 通过KEGG通路分析进一步分析了这些基因，将常表达差异表达的H基因SgRNAs富集于细胞粘附分子（CAMS）和NoT等细胞中，C型基因与代谢、PI3KAKT、肌动蛋白细胞骨架调控、MAPK和FOXO信号通路有关，L型基因提示它们参与VEGF， 肿瘤通路中的紧密连接、细胞周期和异常转录调控。
图2 sgRNA文库筛选识别影响肝肺肿瘤生长和转移的通路。
研究人员对 421 个样本进行了 Kaplan-Meier 分析，发现在 TCGA 的 6,765 个基因中，TCGA 的 385 个基因与 C 组的 385 个基因、L 组的 177 个基因和 H 组的 18 个基因相交。 火山图显示了对 580 个相交 HCC 基因的差异分析，代表了 371 个癌症样本和 50 个癌旁样本的比较以及 50 对匹配的 HCC 和癌旁比较。 在原发性肝肿瘤和肺转移瘤中鉴定富集基因，筛选出影响肿瘤生长和转移的7个基因（polr2l、xage1b、hoxd1、plk4、c17orf99、lmo1和myadml2）。
图3 基因组中富集的sgRNAs的CRISPRA筛选用于肝脏肿瘤的生长和转移
研究人员使用慢病毒递送CRISPRAPolr2L、Xage1B、HoxD1、PLK4、C17ORF99、LMO1 和 MyADML2 以及感染肝癌细胞系 HepG2 和 HUH7 的对照，以验证 CRISPRA 文库筛选出的候选基因对 HCC 细胞表型的影响。 q-PCR证实，所有sgRNA序列均能有效上调HEPG2和HUH7细胞中7个候选基因的表达。 CCK8实验表明，7个候选基因的过表达可显著促进HCC细胞增殖，提高肝癌细胞的存活率。 对7个候选基因高表达的细胞进行细胞侵袭实验，与对照组相比，所有供试基因侵袭的HEPG2细胞数量均显著增加，LMO1、MyADML2、PLK4和XAGE1B的过表达显著促进了HUH7细胞的侵袭，表明这些基因加速了HCC细胞的侵袭。
图4 候选基因过表达促进肝癌细胞增殖和侵袭。
研究人员使用WB检测蛋白表达水平，筛选出抑制效果最好的siRNA，并使用CCK8和Transwell检测细胞增殖和迁移。 结果表明，LMO1、MyADML2、PLK4和XAGE1B的下调在24h、48h和72h时显著抑制HCC细胞的增殖，Transwell实验清楚地表明，与HEPG2和HUH7细胞的SICs组相比，LMO1、MyADML2、PLK4和XAGE1B-siRNA组的侵袭细胞在48h时显著减少。
图5 抑制候选基因表达抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。
研究人员使用癌症谱系学家的RNA测序数据来了解这些候选基因在HCC中的表达谱，并评估TCGA数据库中这些候选基因的表达水平。 结果显示，LMO1、MyADML2、PLK4和XAGE1B高表达的HCC患者总生存期较低，HCC表达较差，单因素分析显示LMO1、MYADML2、PLK4和XAGE1B是HCC患者生存的重要因素。 免疫组化检测MyADML2蛋白在80例HCC组织中的表达，发现MyADML2主要位于细胞质和细胞膜上。 Kaplan-Meier 分析显示，MyADML2 蛋白水平高的 HCC 患者总生存期低于 MyADML2 蛋白水平低的 HCC 患者。 结果显示，LMO1、MyADML2、PLK4和XAGE1B的高表达不仅导致肺转移发生率增加，还影响肝癌的预后，其中MyADML2是最重要的预后因素。
图6 利用癌症基因谱和免疫组化分析候选基因。
研究人员分析了TCGA数据集中15种免疫细胞类型的比例，发现PLK4、LMO1和MyADML2与M0巨噬细胞浸润水平一致，PLK4与树突状细胞浸润水平一致。 此外，PLK4和MyADML2与单核细胞、**B细胞和M2巨噬细胞的浸润水平呈负相关，提示树突状细胞、巨噬细胞和B细胞在促进HCC增殖和侵袭中起重要作用。
图7 肝细胞癌免疫细胞组成分析。
综上所述，研究人员利用CRISPRA文库筛选技术为肝肿瘤侵袭转移相关功能基因的体内筛选提供了路线图，筛选出的LMO1、MyADML2、PLK4和XAGE1B基因的高表达不仅意味着肺转移的概率更高，还会影响肝癌的预后。 这些发现为肝癌的临床诊断、**和预后评估提供了新的潜在生物学靶点。
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