胰腺癌具有高度恶性肿瘤和有限的选择，被认为是全球健康的主要挑战。 虽然化疗是改善局部晚期或转移性胰腺癌预后的最有效手段之一，但化疗耐药性是临床障碍。胰腺癌最有效的化疗方案是叶酸，奥沙利铂是关键的活性剂。 然而，根据目前的数据，只有21%的胰腺癌患者对铂类药物敏感。 因此，有必要研究胰腺癌中铂类耐药的机制以及如何提高铂类敏感性，从而为胰腺癌提供思路。
细胞外囊泡（EVS）是一种新的细胞间通讯方式，它携带各种生物活性分子来调节受体细胞的活性。 此外，环状RNA（circRNA）在EV中丰富且稳定，可以在细胞之间发挥特定功能。 已发现外泌体中的 circRNA 在介导肝细胞癌顺铂化疗耐药性中起重要作用。 然而，EV包封的circRNA在胰腺癌铂类耐药中的作用尚未得到广泛探索。
今年6月，广东省人民医院陈如福教授团队在cancer research（if=11.2）发表文章淋巴结转移性胰腺导管腺癌-circarfgef2的潜在靶点已被探索，为胰腺癌的诊断和发展提供了有力的参考。
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同年11月28日广东省人民医院陈如福教授团队在journal of experimental & clinical cancer research（if=11.3） 再版，CircRNA在胰腺癌诊断中的应用 **方向关于来自癌症相关成纤维细胞的细胞外囊泡包装的circbirc6的最新文章，在胰腺癌中通过sumoylation调节诱导铂抗性。 在这项研究中，作者鉴定了一种环状RNA，CircBIRC6，富集于肿瘤相关成纤维细胞（CAF）产生的EVs中，它在胰腺导管腺癌（PDAC）的化疗耐药性中起关键作用。 CircbiRC6在CAF中的表达与奥沙利铂化疗耐药性呈正相关。 Circbirc6 通过调节非同源末端连接 （NHEJ） 依赖性 DNA 修复来增强胰腺癌细胞和类器官对奥沙利铂的耐药性。 这是它的工作原理，CircBIRC6直接与XRC4结合，增强XRC4与SUMO1在赖氨酸115残基上的相互作用，从而促进XRC4染色质的核定位，增加奥沙利铂耐药性。 单独使用奥拉帕尼与circbirc6和circbirc6联合使用的抑制剂可显着抑制奥沙利铂化疗耐药性。
为了研究铂类化疗耐药中参与CAF的关键环RNA，我们对奥沙利铂耐药患者的CAFS和正常邻近组织相关成纤维细胞（NAF）进行了高通量测序+qPCR分析，并筛选了10个上调的circRNA（图1A）。 然而，在这些circRNA中，与奥沙利铂敏感患者相比，CAFS中只有Circbirc6显著高于奥沙利铂耐药患者高表达的 Circbirc6 与较短的无进展生存期 （PFS） 密切相关（图 1C-E）;在未接受铂类化疗**的患者中，CircBIRC6 表达不再与 PFS 相关（图 1F）。这表明circbirc6与奥沙利铂耐药性密切相关。 CircBIRC6 起源于 BIRC6 基因的外显子 2 10，通过环形成和 RNA R 和放线菌素 D 实验验证了其环化和耐受性（图 1G-I）。 总结一下技巧，Circbirc6 是一种共价阻断的环状 RNA，与奥沙利铂耐药性密切相关。
作者进一步阐明了铂类抗性PDAC中导致Circbirc6上调的分子机制。 据报道，RNA 结合蛋白 （RBPS） 调节 circRNA 的产生。 圆环组分析和qPCR结果以及RIP验证结果显示EIF4A3 蛋白结合并促进 Circbirc6 的产生。
图1 Circbirc6与奥沙利铂耐药性密切相关。
如前所述，CircBIRC6 富集于 CAF 而不是 NAF。 有趣，Circbirc6 也是 CAFS 的富集培养基（cm）而不是 NAFS（图 2a-b）。 与NAF-CM共培养或单独PDAC细胞相比，CAF-CM共培养PDAC细胞系中CircBIRC6水平显著升高提示 Circbirc6 可以递送至 PDAC 细胞系中。细胞外Circbirc6研究发现，RNA处理对CAF-cm中Circbirc6水平不影响;用RNase和Triton X-100（透化溶液）联合处理降低了CAF-cm中Circbirc6的水平（图2C）。，表明 CircBirc6 可能存在于 CM 的 EV 中。此外，用毒蕈碱鹅膏菌（CAF-CM共培养）处理PANC-1细胞可抑制内源性转录，并且不影响Panc-1细胞中Circbirc6的升高（图2D）。再次，有人建议EV-Circbirc6可以递送至Panc-1细胞并富集。 总结一下技巧，EV-Circbirc6 富集于 CAF-CM 中，可递送至肿瘤细胞中。
为了确认细胞外 Circbirc6 被包裹在 EV 中，作者从 CAF-CM 中分离出 EV。 Nanosight 和 WB 验证了电动汽车的形态、大小和生物标志物（图 2E-G）。 EV中CircBIRC6的水平与CAF-CM中几乎相同（图2H）。这意味着 CircBIRC6 富集在 CAF 分泌的 EV 中，而不是直接释放。 此外，血浆 EV 包封的 CircBiRC6 水平与配对的 CAF-EV-Circbirc6 水平呈正相关（图 2i）。结果表明，血浆EV-Circbirc6主要来源于PDAC微环境中的CAF。
图2 CAF-ev-circbirc6可以递送至肿瘤细胞中。
为了探索CAF-CIRCBIRC6在体外对奥沙利铂耐药性的调控，作者首先在CAFS中分离出EVs，分别过表达和敲低CircbiRC6（图3A-B）。随后，PDAC细胞系与这些EV共同孵育。 结果显示过表达 Circbirc6 的 CAF-EV 对奥沙利铂表现出更高的半抑制浓度值和更高的细胞增殖**，而沉默 Circbirc6 则相反（图 3c-f）。 此外，CAF-EV-circBIRC6 可减弱奥沙利铂诱导的 PDAC 细胞凋亡并促进胰腺癌类器官增殖CAF-ev-SH-circbirc6 的情况正好相反（图 3G-J）。 综上所述，在离体研究中，CAF-EV-circbirc6可以正向调节奥沙利铂耐药性。
图3 CAF-EV-circBIRC6可以正向调节奥沙利铂耐药性。
Circbirc6 通过 NHEJ 通路诱导奥沙利铂耐药
为了进一步阐明EV-CircBirc6驱动的奥沙利铂耐药机制，作者对CAF和敲除CircbiRC6的对照细胞进行了测序和KEGG分析，发现：DNA修复途径的富集（图 4a）。 双链 DNA 断裂（dsb）修复被认为是奥沙利铂耐药的关键机制之一。 随后，作者使用中性彗星测定法（检测DNA双链断裂损伤）来研究EV-CircBIRC6是否改变了PDAC细胞中DSB修复的效率。 结果表明，CAF-EV-CIRCBIRC6组的彗尾较短，H2AX水平降低，而CAF-EV-SH-CIRCBIRC6组则相反，表明CIRCBIRC6促进了DSB修复（图4B-E）。 HR 和 NHEJ 是 DSB 修复的关键途径。 CAF-EV-Circbirc6 提高了 NHEJ 的效率，但不能提高 HR（图 4F-G）。 SCR7可以抑制NHEJ通路，实验结果表明SCR7可以逆转CAF-EV-circBIRC6促进肿瘤细胞增殖的作用H2AX分析结果是一致的（图4H-I）。 综上所述，结果表明：Circbirc6通过NHEJ通路介导奥沙利铂耐药性，阻断NHEJ通路可消除CIRCBIRC6对奥沙利铂耐药性的影响。
图4 Circbirc6通过NHEJ通路诱导奥沙利铂耐药。
确定CIRCBIRC6提高NHEJ修复效率的机制，作者还通过RNApulldown + MS+ WB + RIP测定确定CircBIRC6与Panc-1细胞中的XRC4结合（图5A-E）。 Caf-ev-sh-circbirc6 不影响 Panc-1 细胞中的 XRCC4 mRNA 和蛋白质水平（图 5F-G）。 竟然作者发现，CAF-EV-CIRCBIRC6增强了XRC4向染色质的募集（促进XRCC4核定位并提高NHEJ修复效率），而CAF-EV-SH-CIRCBIRC6则相反（图 5h）。 接下来，作者合成了 CircBirc6 的分段探针，并确定 CircBirc6 的 400-600 nt 区域对 XRCC4 相互作用至关重要（图 5i-j）。 非编码RNA通常通过茎环结构与蛋白质相互作用。 我Circbirc6 （500-545） 形成双链茎环结构该位点的突变也会损害将XRC4蛋白撕裂的Circbirc6的数量以及XrcC4核定位（图5L-M）。
图5 Circbirc6与XRCC4结合。
翻译后修饰（PTM）在蛋白质定位中非常重要。 为了鉴定参与 XRCC4 核定位的关键 PTM，我们用 CAF-EV 和各种 PTM 抑制剂处理 PANC-1 细胞。 CAF-EV促进xrcc4核定位;抑制 SUMO 修饰 （2-D08） 抑制 XRCC4 核定位（图 6a）。 Co-IP结果还证实，SH-circBIRC6显著降低了修饰剂SUMO1与XRC4的连接，但没有显著改变XRC4的泛素化、磷酸化或甲基化（图6B）。 这提示CircBirc6 影响 XRCC4 的 SUMO 修饰。Co-IP分析表明：，CircBIRC6 通过 SAE1 增强 XRCC4（相扑活酶）。相互 作用（图 6c）。。Si-SAE1 减弱 SUMO1 对 XRC4 的修饰并抑制 XRC4 的核定位（图 6D-E）。 考虑到修饰残基在SUMO修饰对靶蛋白影响中的重要作用，我们使用GPS-SUMO（**SUMO修饰）在XRCC4上鉴定了两个潜在的SUMO修饰位点（K115和K210）（图6F-G）。 实验表征，K115R突变而非K210R突变显著阻碍了XRC4的SUMO修饰和核定位（图 6h-j）。 然后，作者研究了 SUMO 修饰依赖性 xrcc4 核定位是否是 EV-CircbiRC6 介导的奥沙利铂耐药所必需的。 结果是显而易见的XRCC4 的 K115R 突变抵消了 EV-CircbiRC6 诱导的奥沙利铂耐药性（图 6k）。 综上所述，EV-Circbirc6 通过 SUMO 修饰途径促进 xrcc4 核定位，从而促进奥沙利铂耐药性。
图6 EV-Circbirc6通过SUMO修饰正向调控XRC4的核定位，促进奥沙利铂耐药。
为了研究EV-CircBIRC6在体内的作用，将XRCC4-WT或XRC4-mut转导的PANN-1细胞注射到小鼠的胰尾中，并用奥沙利铂和CAF-EV处理原位异种移植小鼠（图7A）。 静脉注射 CAF-EV-circBIRC6 导致化疗反应差、肿瘤体积大、DSBS 水平降低和细胞凋亡，而 XRCC4 突变逆转了这些作用并抑制了肿瘤生长（图 7b-f）。
为了评估 CircbiRC6 XRCC4 轴的潜在价值，作者在临床奥沙利铂耐药患者中建立了异种移植 （PDX） 小鼠模型，并使用靶向 CircbiRC6 的反义寡核苷酸 （ASO） 抑制剂进行检测（图 7G）。 不出所料AASO-circbirc6**显著改善了化疗反应。 此外，奥沙利铂联合ASO-circbirc6和奥拉帕尼可显着改善化疗反应（图 7h）。 IHC分析显示，ASO-circbirc6或ASOCIRCBIRC6与奥拉帕尼**联合使用可增加DSBS水平和细胞凋亡（图7i）。 综上所述，Caf-ev-circbirc6 通过 SUMO 修饰途径正向调控 XRC4 的核定位，促进奥沙利铂耐药性。
图7 EV-circBIRC6诱导胰腺癌对奥沙利铂的耐药性。
为评估CIRCBIRC6对奥沙利铂化疗的反应价值和临床意义，作者检测了82例接受奥沙利铂化疗的晚期PDAC患者血浆EVs和原发肿瘤组织中CIRCBIRC6的表达，并通过免疫染色评估了H2AX中DNA损伤的水平。 结果显示，与非耐药组织相比，耐药患者肿瘤组织中CircBIRC6水平升高，H2AX水平降低（图8A-C）。Circbirc6的表达与H2ax的表达呈负相关（图8D）。作者还测量了SUMO修饰的XRCC4水平，发现耐药患者肿瘤组织中XRCC4水平升高，化疗反应性减弱（图8E-G）。 此外，与奥沙利铂反应敏感的患者相比，耐药患者的血浆 EV-circbirc6 水平升高（图 8h）。 Kaplan-Meier分析表明，血浆EV-CircBirC6含量越高，PFS越短（图8i）。 然而，有趣的是，无论血浆EV-CircbirC6水平如何，接受其他无奥沙利铂化疗方案的患者的PFS均无显著差异（图8J）。 综上所述，Circbirc6 可作为基于奥沙利铂的化疗耐药性在胰腺癌中的潜在**和生物标志物（图 8k）。
图8 Circbirc6与PDAC患者的DNA损伤和奥沙利铂耐药性相关。