首先，我们收获细胞或组织并制备单细胞悬浮液。 然后，我们将单细胞悬浮液转移到 96 孔板、管或聚苯乙烯圆底管中，具体取决于所用细胞的数量和体积。
所需材料：
细胞悬浮液聚苯乙烯圆底 12 75 mm2 Falken 管，装在 96 孔板（或与您的离心机兼容的任何容器）中。
悬浮液洗涤缓冲液（PBS，5-10%胎儿细胞血清（FCS））。
可选红细胞裂解缓冲液（例如，R377982）。
第 1 步
大约需要20分钟。
根据指南收获和洗涤细胞。
1.1 对于血液样本，我们建议将样本与红细胞裂解缓冲液（例如R377982）一起孵育。
提示 1：红细胞裂解缓冲液裂解红细胞，这可能会干扰白细胞（有核细胞）的分析。
提示 2：通过避免气泡、剧烈涡旋、在缓冲液更换期间吸入整个溶液以及过度离心来防止细胞损伤。
确定细胞总数并检查细胞活力。
2.1 一般来说，成活率应为90-95%。
离心并将细胞样品重悬于冰冷的悬浮缓冲液中。
3.1.在4°C下以约200g离心5分钟，32 推荐悬浮细胞浓度：05 1 106 细胞毫升。
提示：旋转时间和速度可能需要优化。 一般来说，细胞应充分离心以除去上清液，但为了不引起细胞损失，离心力不宜过强，以防止细胞难以复活。
警告：较高的细胞浓度可能会堵塞流式细胞术系统并影响分辨率。
继续用活性染料染色。
由于死细胞容易与抗体发生非特异性结合，因此将这些细胞排除在分析之外非常重要。 使用活性染料使我们能够区分活细胞和死细胞，并在数据采集和分析过程中排除死细胞。
DNA 结合染料（例如 7-AAD、DAPI 和 TOPRO3）通常用作活性染料，用于对活细胞中的死细胞进行染色，因为它们无法穿透活细胞的细胞膜。 死细胞中受损的细胞膜使这些染料与 DNA 接触、与 DNA 结合并发出荧光。
但是，这些染料不能用于固定细胞的活死染色，否则所有细胞的细胞膜都会受到损害。 在这种情况下，我们必须使用胺反应性可固定细胞活力染料。
所需材料：
活性染料。 不可固定染料示例：7-AAD、DRAQ-5、DRAQ-7 或 DAPI
可固色染料。
悬浮液：洗涤缓冲液（例如，PBS、5-10% 胎儿细胞血清 （FCS））。
第 1 步
用活染料对细胞进行染色。
1.根据制造商的说明，在4°C下在黑暗中用染料孵育细胞。
注意：将荧光基团置于黑暗中，以避免光漂白。
提示：选择其发射光谱与用于免疫染色的荧光团不重叠的染料。
用洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
2.向下旋转细胞（200g，5分钟，4°C），除去上清液，并在每次洗涤后重悬沉淀。
提示：洗涤步骤数、脱水时间和速度可能需要优化。 当使用过量的洗涤缓冲液并在离心后尽可能多地去除液体时，一个洗涤步骤可能就足够了。
检测到细胞外靶标时继续阻断，或细胞内靶标的固定和透化。
当对细胞内靶标进行染色时，我们必须执行额外的固定和透化步骤。 保留细胞内蛋白质的结构需要固定。 透化会破坏细胞膜，使抗体进入细胞并染色细胞内靶标。
当对细胞外靶标进行染色时，我们将立即进行封闭步骤。 当同时分析细胞内和细胞外靶标时，我们需要在固定和透化之前进行细胞表面染色（见第 5 阶段）。
选择正确的细胞内染色固定和透化方法的有用提示：
靠近质膜的抗原和可溶性细胞质抗原需要轻度的细胞通透，无需固定。
细胞骨架、病毒和某些酶抗原在用高浓度丙酮、酒精或甲醛固定时通常产生最佳效果。
细胞质细胞器和颗粒中的抗原是否需要固定和透化方法取决于抗原。
表位需要保持可访问性。
所需材料：
细胞悬浮液。 悬浮缓冲液（PBS，5-10%FCS）。
固定剂（例如，1-4% 多聚甲醛、90% 甲醇或丙酮）。
透化溶液（例如，Triton X-100、NP-40 或皂苷）。
或者，您可以使用适用于大多数样品类型的流式细胞术固定和透化试剂盒。
第 1 步
大约需要 1 小时 15 分钟。
用您选择的固定剂固定细胞。
1.1将细胞离心成沉淀（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，并将沉淀重悬于固定剂中。
1.2 将细胞与固定剂一起孵育，如下所示。
提示：需要针对不同的抗原优化固定。 一些表位对甲醇非常敏感，所以如果测试有任何问题，请尝试丙酮。
定影剂。 时间。
1-4%多聚甲醛（PFA）。
在冰上15-20分钟。
90% 甲醇。
20°C10分钟。
100% 丙酮*
在冰上10-15分钟。
聚苯乙烯塑料管不适合与丙酮一起使用。
用悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
2.1离心细胞（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，重悬于洗涤缓冲液中。
提示：可以优化洗涤步骤的数量、脱水时间和速度。 当使用过量的洗涤缓冲液并在离心后尽可能多地去除液体时，一个洗涤步骤可能就足够了。
通过用合适的洗涤剂孵育细胞来透化细胞。
3.1将细胞离心成沉淀（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，重悬于洗涤剂溶液中。
3.2 在室温下将细胞在洗涤剂中孵育 10-15 分钟。
注意：如果使用丙酮作为固定剂，则不需要此步骤，因为丙酮也可以透化细胞。
提示 1：最佳洗涤剂的选择取决于蛋白质及其定位。 强力去污剂（如Triton或NP-40）可部分溶解核膜，因此适用于核抗原染色。 相比之下，温和的去污剂，如吐温 20 或皂苷，使抗体能够在不溶解质膜的情况下通过孔隙，这使得它们适用于细胞质或质膜细胞质表面的抗原和可溶性核抗原。
提示 2：洗涤剂的浓度应根据您的样品进行优化。 提示 3：透化会影响流式细胞仪上细胞的光散射曲线; 在检测和数据分析期间（第 6 阶段）对细胞群进行门控时，请记住这一点。
用悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
4.1离心细胞（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，重悬于洗涤中缓慢冲洗。
提示：洗涤步骤数、脱水时间和速度可能需要优化。 当使用过量的洗涤缓冲液并在离心后尽可能多地去除液体时，一个洗涤步骤可能就足够了。
执行后续阻止步骤。
阻断蛋白质和 Fc 结构域对于防止抗体与细胞的非特异性结合至关重要。
所需材料：
材料的选择取决于所分析细胞的类型，如果适用，还取决于所使用的二抗
FCR 阻断缓冲液（例如，2-10% 山羊血清、人 IgG 或小鼠抗 CD16 CD32）。
悬浮缓冲液（PBS，5-10%FCS）。
第 1 步
大约需要45分钟。
用封闭缓冲液阻断FC受体。
1.1将细胞离心成沉淀（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，重悬于封闭缓慢冲洗中。
1.将细胞与缓冲液在 4°C 的黑暗中孵育 30-60 分钟。
用洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
2.向下旋转细胞（200g，5分钟，4°C），除去上清液，并在每次洗涤后重悬沉淀。
提示：洗涤步骤数、脱水时间和速度可能需要优化。 当使用过量的洗涤缓冲液并在离心后尽可能多地去除液体时，一个洗涤步骤可能就足够了。
继续进行抗体孵育。
我们现在已经准备好用荧光团偶联抗体对细胞进行染色，以便在流式细胞术中进行间接或直接检测。
以下程序也可以重复并应用于多色流式细胞术，其中多组荧光团偶联抗体用于对抗不同的靶标。 当使用多组抗体时，我们应该尽量减少荧光团发射光谱的重叠。
直接抗体标记
所需材料：
偶联成一种抗体。 示例 （05-1细胞悬液106ml）。
悬浮缓冲液（PBS，5-10%FCS）。
第 1 步
时间大约是40分钟。
在悬浮缓冲液中稀释结合的一抗。
1.1 每种抗体的推荐稀释度通常在数据表上提供。
提示：通过连续稀释滴定抗体将帮助您找到最适合实验的抗体浓度。
在预稀释的一抗中孵育细胞。
2.离心细胞（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，并将细胞重悬于抗溶液中。 2.在2°C和4°C下在黑暗中孵育20-30分钟。 固定细胞可在室温或4°C下孵育。
提示：此步骤可能需要优化。
注意：将荧光基团置于黑暗中，以避免光漂白。
用悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
3.离心细胞（200g，5分钟，4°C），除去上清液，每次洗涤后重悬。
3.2 提示：洗涤步骤数、脱水时间和速度可能需要优化。 当使用过量的洗涤缓冲液并在离心后尽可能多地去除液体时，一个洗涤步骤可能就足够了。
尽快进行流式细胞术检测。
4.1 如果在抗体染色后（1 小时内）未立即在流式细胞仪中分析细胞并且未预先固定，则可以在此步骤（1-4% PFA，4°C，20 分钟）固定染色的细胞。 固定有助于将细胞保存数天，稳定光散射，并使大多数生物危害剂失活。 控件需要使用相同的程序固定。 请注意，固定会杀死细胞，并且与不可固定的细胞活力染料不相容（如果这些染料以前使用过）。
提示：孵育后立即获得最佳结果。
警告：如果您打算实时研究细胞，请不要修复它们。
4.2 固定后洗涤细胞3次，并将细胞悬液储存在悬浮缓冲液中。
4.3 按照使用说明进行操作。
提示：将细胞保存在深色冰上或4°C冰箱中，直到您预定的分析时间。
间接抗体标记
间接标记需要两个孵育步骤，首先是一抗，然后是相容的二抗。 二抗（而非一抗）与荧光染料（FITC、PE、Cy5 等）偶联。
所需材料：
一抗。 偶联二抗。
示例 （05-1细胞悬液106ml）。
悬浮液洗涤缓冲液（PBS，5-10%FCS）。
第 1 步
时间约为1小时15分钟。
在悬浮缓冲液中稀释一抗和二抗。
1.1 每种应用的推荐稀释度通常在抗体数据表上提供。
提示：通过连续稀释滴定抗体将帮助您找到最适合实验的抗体浓度。
在预稀释的一抗中孵育细胞。
2.1离心细胞（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，重悬于一抗溶液中。
2.在2°C和4°C下在黑暗中孵育20-30分钟。 固定细胞可在室温或4°C下孵育。
提示：孵育时间可能需要优化。
用悬浮缓冲液洗涤细胞两次。
3.每次洗涤后，旋转细胞（200g，5分钟，4°C），除去上清液并重悬沉淀。
提示：洗涤步骤数、脱水时间和速度可能需要优化。 当使用过量的洗涤缓冲液并在离心后尽可能多地去除液体时，一个洗涤步骤可能就足够了。
在预先稀释的二抗中孵育细胞。
4.1离心细胞（200g，5分钟，4°C），弃去上清液，并将沉淀重悬于二抗溶液中。
4.2 在黑暗中孵育 20-30 分钟 重要的是要将荧光团保持在黑暗中以避免光漂白。
用洗涤缓冲液洗涤细胞两次。
5.1将细胞离心成沉淀（500g，5分钟，4°C），弃去上清液，并重悬于洗涤缓冲液中。
提示：洗涤步骤数、脱水时间和速度可能需要优化。 当使用过量的洗涤缓冲液并在离心后尽可能多地去除液体时，一个洗涤步骤可能就足够了。
尽快进行流式细胞术检测。
6.1 如果在抗体染色后（1 小时内）未立即在流式细胞仪中分析细胞并且未预先固定，则可以在此步骤（1-4% PFA，4°C，20 分钟）固定染色的细胞。 固定有助于将细胞保存数天，稳定光散射，并使大多数生物危害剂失活。 控件需要使用相同的程序固定。 请注意，固定会杀死细胞，并且与不可固定的细胞活力染料（如果以前使用过）不相容。
提示：孵化后立即获得最佳效果。
警告：如果您打算实时研究细胞，请不要修复它们。
6.2 固定后洗涤细胞3次，并将细胞悬液储存在悬浮缓冲液中。
6.3 按照说明进行数据收集。
提示：将细胞保存在深色冰上或4°C冰箱中，直到您预定的分析时间。
抗体孵育后，我们可以在流式细胞仪中进行实验。 该过程很大程度上取决于所使用的设备，因此请务必先与制造商联系。
当表面染色的细胞存活且未固定或透化时，可以使用荧光激活细胞分选 （FACS） 分离它们。 使用FACS，活细胞可以根据其特征分组到不同的群体中。 然后，我们可以对分离的细胞进行下游分析。
欲了解更多信息，请访问我们的网站，该网站旨在帮助您从细胞中获取最佳数据。