1975年，德国学者Kohler和Milstein成功地将骨髓瘤细胞和产生抗体的B淋巴细胞融合成杂交瘤细胞，杂交瘤细胞具有B淋巴细胞只能产生针对特定表位的单克隆抗体的特征，也具有肿瘤细胞无限增殖的特性。 杂交瘤技术的诞生开创了抗体生产和使用的新时代。 小鼠杂交瘤单克隆抗体**稳定，后期易于制备，且得率高，是免疫检测分析和早期疾病筛查最常用的抗体。 小鼠杂交瘤的制备过程包括以下步骤：抗原鉴定后的制备、动物免疫、血清滴度的测定、滴度达到要求后，脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经HAT和HT选择性培养基筛选和间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选确认后，得到的杂交瘤不仅可以无限增殖， 但也分泌对抗原特异性的杂交瘤抗体。
B细胞富集和筛选
小鼠的淋巴器官由多种类型的细胞组成，包括非B细胞系（40%-60%）和表达Igm的幼稚B细胞（40%-60%）和其他淋巴细胞（<5%），其中任何一种都可以用于融合，但只有表达IgG的B细胞（主要是浆细胞）与骨髓瘤融合才能形成单克隆抗体分泌杂交瘤细胞， 只有一小部分细胞（02%-5%）表达抗原特异性抗体。传统的杂交瘤技术是以聚乙二醇（PEG）为融合剂，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选杂交瘤，融合效率低，可以通过筛选和富集浆细胞来提高融合率。
目前，B细胞的分选主要通过流式细胞术完成。 B 细胞可以用 CD45R 免疫磁珠富集，然后进行流式细胞术，用于荧光标记的 CD19 抗体和具有 IgG+ 双荧光信号的单个 B 细胞。 液滴微流控还用于抗原特异性单个 B 细胞的分类和封装。 用这种方法筛选的B细胞活力较差。
融合技术的改进
常规的杂交瘤融合技术主要是在PEG的作用下，将一定比例的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞。 电融合技术是指在电脉冲场的作用下，将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，避免了常规融合技术对化学试剂的污染。 电融合法产生杂交瘤的效率仍然较低，因为融合前两个细胞的测序是随机结合的，特别是当两个细胞大小差异较大时，测序电压更容易使大细胞与大细胞接触，需要融合的两个细胞的接触机会减少， 导致聚变效率下降。在电融合前，分别使用生物素和链霉亲和素标记脾细胞和骨髓瘤细胞，然后将两个细胞相互配对。 结果表明，用生物素和链霉亲和素处理脾细胞和sp2 0细胞，增加了两个细胞之间的接触机会，降低了相同细胞融合的机会。 因此，改良电融合法制备的杂交瘤数量明显高于普通电融合法，大大提高了融合效率。 脾细胞也与CPG寡脱氧核苷酸共孵育，然后电熔，这增加了融合速率和产生抗体的细胞数量。
阳性杂交瘤分选
常规的杂交瘤阳性筛查方法是在杂交瘤融合、选择性培养基和间接ELISA筛选后，采用限制稀释法获得单克隆杂交瘤细胞。 限制稀释法每次亚克隆培养时间需要7-10天，需要间接ELISA阳性确认，亚克隆不能一次获得单个杂交瘤细胞，需要反复重复，直到克隆出单个细胞。 细胞培养既繁琐又费力，并且可能导致在多次克隆中丢失其他一些杂交瘤细胞亚型。
芯片筛选
使用芯片进行杂交瘤筛查有几个优点：一是抗原高灵敏度的测定方法，芯片微孔中细胞的含量相对较小，产生的抗体量也相对较小; 二是芯片体积小，吞吐量高，可以测试大量的克隆，避免克隆的丢失; 三是筛选时间，芯片中的杂交瘤占用的空间相对较小，在短时间内需要进行测量和筛选。
微流控筛选
微流控从操作方式上分为流水线微流控和液滴微流控，细胞分选中使用的微流控较多，而液滴微流控主要用于阳性杂交瘤的筛选。 在液滴微流控中分离液滴中的单个细胞，可以进行细胞或分泌蛋白分析，克服了传统流式细胞术和荧光激活细胞分选的一些主要限制。 如下图所示，在一个50PL的液滴中，荧光探针和涂有抗小鼠IgG抗体的单珠联合分割单个小鼠杂交瘤细胞，经过15分钟的细胞培养，单珠捕获分泌的抗体，当捕获的抗体与探针结合时，荧光位于珠子上， 产生清晰可辨的荧光，经检测器鉴定后，分拣出分泌抗体的杂交瘤，丢弃不分泌抗体的杂交瘤。
流式过滤
流式细胞术是以荧光标记的抗原和抗体亚型结合免疫球蛋白为筛选指标，可全自动、快速、高效地筛选抗原特异性和有活力的杂交瘤细胞。 研究人员使用过氧化物酶标记的半抗原与荧光标记的抗过氧化物酶的抗体偶联物来检测抗体的特异性，使用荧光标记的抗小鼠IgG抗体来识别抗体分泌，并使用荧光激活的细胞分选技术将融合混合物中的半抗原特异性单个杂交瘤细胞分选到多孔板中进行培养，这通过直接竞争ELISA检测方法得到证实。 该方法避免了繁琐的重复筛选和克隆过程，为制备其他半抗原特异性抗体提供了参考。
德泰生物为您提供快速杂交瘤单克隆抗体开发服务，将快速免疫平台与DeepLight细胞筛选平台相结合，提供从抗原制备到ELISA、FACS等多平台验证的一站式服务。 我们根据抗原的性质选择最佳免疫方案，用于免疫的BALB C小鼠为SPF级; 纯化的抗体ELISA滴度保证为1 128000，递送的单克隆抗体可用于ELISA、免疫组化、体外诊断检测等下游实验。 您也可以选择基于单B细胞抗体开发技术的SingleB快速单克隆抗体开发服务，从免疫到单克隆抗体，最快29天。
小鼠杂交瘤单克隆抗体的开发仍具有挑战性，当靶向单个结构特异性靶点时，低融合率可能不会影响获得抗体的最终目的，但对于含有多个靶点的抗原，如致病菌，低融合率可能在筛选和获得特异性抗体方面起决定性作用。 对于这类多靶点抗原，通常通过测序获得病原体的序列，通过生物学信息可以准确获得病原体的特异性膜蛋白，但仍存在靶点为糖蛋白，糖蛋白空间结构不能**的现象，容易对重组蛋白产生亲和力，不能实现理论上含有的病原菌的全覆盖这个目标。目前，通过抗原特异性B细胞受体的高通量测序，并进行计算、评价和评分，筛选出特异性强、广谱的单克隆抗体序列，从而实现预选检测抗原。
小鼠杂交瘤单克隆抗体的快速制备技术涉及抗原设计筛选、B细胞富集筛选、肿瘤细胞修饰、融合技术改进、阳性杂交瘤细胞筛选和单克隆抗体性能快速测定等多个环节。
引用
方水琴、刘成、马俊飞等 小鼠杂交瘤单克隆抗体快速制备研究进展[J].中国生物工程学报，2021,37（07）：2293-2306