“我坚信，markless将被主流所接受，甚至在许多方面超越传统的测试方法。 ”——中国科学技术大学褚凯勤教授在谈到生化颗粒检测技术的未来方向时自信地说。
那么究竟什么是“无标记”呢？
“无标记”是指在不进行荧光染色的情况下对化学样品的物理和化学性质进行监测、参数表征和相关分析。 具有无光漂移或光毒性，对样品制备要求低，及时全景观察等优点。
相较于对细胞样品具有严重破坏性或光毒性的“免疫沉淀”和“荧光染色”，“无标记”可以在不破坏样品原始状态的情况下，长时间最大化观察结果，并且以这种方式获得的结果最接近样品在自身环境中的性能。 无论是对生物样品活性的观察，还是对药物作用机制的研究，“无标记”可能是未来最科学、最有价值的参考方式。
然而，如果不对样品进行标记，样品中那些小而微弱的颗粒是很难观察到的，特别是在快速活动或结块的状态下。 这些问题可能会阻碍“无标记”生化检测技术的应用。
楚凯勤教授团队多年致力于拉曼信号分析技术、图像算法等领域的研究，并成功打破了行业内的这一技术壁垒，让“无标记”服务于生化检测领域，并取得了一系列优秀的研究成果。
在这里，我们必须清楚“拉曼”的概念。
拉曼信号是一种非常微弱的非弹性散射信号（只有散射光的1 10 9左右），与瑞利散射（散射光与入射光的波长相同）相比，拉曼信号的波长会随着被测样品化学结构的不同而变化，具有很大的应用价值。 然而，由于信号较弱，在实际应用中面临多重技术障碍。 褚凯勤教授及其团队致力于拉曼信号分析技术的应用和研究，通过对单粒子光镊自动捕获和释放技术、相位引导拉曼分析、拉曼信号算法分析等方面的研究，拉曼信号分析技术在具体的研究项目中得到应用，“无标记”生化检测技术在多个方面取得了突破。接下来，就为大家介绍一下楚凯勤教授团队研发的“踢馆”传统检验检测方法的一系列成果。 内容较长且可选**，专业人士可以在每个系统章节的末尾找到**地址**。 纳米颗粒多参数表征分析系统
这是一个由多模态光镊系统+综合控制系统+多模态数据分析系统组成的平台，可以利用拉曼信号分析技术，对粒径在100nm-500nm范围内的颗粒进行“单颗粒”水平上快速表征功能化纳米颗粒和病毒、细菌、外泌体、亚细胞器等天然生物纳米颗粒的理化生化性质。
该系统的三大特点：
“单颗粒”表征技术实现了单个颗粒的多个参数同时表征，如尺寸、折射率、组分的绝对分布等信息。 特别适用于单颗粒异质性高的样品分析。
支持自动捕获和释放样品溶液中的单个颗粒。
在深度学习算法的支持下，在完整和欠定化学模型的光谱分析中，自动去除背景，实现高速计算。
系统参数：
适用尺寸范围：100nm-500nm;
表征20-100小时的通量;
拉曼光谱信号采集时间最快<10s;
尺寸、折射率和化学成分的表征精度误差分别不高于%和5%。
应用：
物理、制药、能源材料、环境、功能产品等领域。
如：外泌体大小及化学成分分析;
脂质体封装技术的药代动力学研究;
药物包封率的检测与分析;
表征和分析其他异质性的单个颗粒参数。
实验案例展示：
图1 系统测试结果
我们使用不同尺寸和材料的标准纳米球进行验证，临床血浆的载药脂质体和外泌体**。 （上图）标准颗粒上校准系统的粒径、折射率和化学成分的表征误差。 （中）可以进一步验证纳米脂质体上的系统表征（下图） 通过多模态数据可以进行纳米颗粒的定量成分分析和分层分析。 最终校准得到的化学成分粒径、折射率和定量表征精度的误差率分别为3-5%和1%5% 和 48%。
图1（上）和（中）也显示，粒度测试结果与商业仪器的结果吻合良好。 如图1（下图）所示，通过多模态数据的正交信息融合，系统可以进一步提取独特的形态信息，如层状度（即脂质体中磷脂双层的数量），其分析结果往往与“标准”冷冻电镜成像的分层统计相似。
图2：血浆外泌体的临床特征。
a） 表征血浆外泌体的粒径、折射率和化学成分。（b）基于PCA+HCA的外泌体簇分析。 （c）不同同种型外泌体的成分差异。 （d） 训练和验证集中不同同种型的外泌体的平均光谱。
这些数字和数据均来自我们项目组的实验，并在Analytical Chemistry、The Analyst、BioMed Opt Express等期刊上发表论文4篇。
引文**：1. combined morpho-chemical profiling of individual extracellular vesicles and functional nanoparticles without labels，yichuan dai, suwen bai, chuanzhen hu, kaiqin chu, bing shen*, and zachary j. smith*
anal. chem. 2020, 92, 7, 5585–5594
2. hybrid principal component analysis denoising enables rapid, label-free morpho-chemical quantification of individual nanoliposomes，yichuan dai*, yajun yu, xianli wang, ziling jiang, yulan chen, kaiqin chu, and zachary j. smith*
anal. chem. 2022, 94, 41, 14232–14241
3. multicomponent raman spectral regression using complete and incomplete models and convolutional neural networks†，derrick boateng, chuanzhen hu, yichuan dai, kaiqin chu, jun du* and zachary j. smith *
the analyst. 2022, 147(20)
4. deep learning-based size prediction for optical trapped nanoparticles and extracellular vesicles from limited bandwidth camera detection，derrick boateng, kaiqin chu, zachary j. smith, jun du,and yichuan dai
biomed opt express. 2024 jan 1; 15(1): 1–13.
相位引导拉曼采样分析系统
这是一种由无标记相位显微镜+深度学习+拉曼光谱组成的新型观察方案，可实现细胞器的长期、无标记、快速的“形态化学”多模态观察。 该系统可用于通过图像采集和分析来表征细胞器的形态信息（大小和位置）和上下文信息（与其他细胞器的关系，如脂滴到线粒体、脂滴和细胞核），可用于相关性分析。
该系统的四大特点：
检测速度很快，在传统的拉曼显微镜扫描过程中，甚至可能需要一天时间才能获得单个细胞内的信噪比（SNR）细胞器群谱。 我们能够在受控的测量时间内（每个细胞大约10分钟）轻松获得SNR，并且每个光谱都有一个SNR。 动态跟踪亚微观细胞器（例如脂滴）和生化参数的体内表征。 过耦合高分辨率相位成像和拉曼光谱能够准确收集细胞器簇内单个细胞器的光谱。 对于具有非空间均匀性的细胞器（例如，相分离的巨型单层囊泡），可以使用混合采样方法，其中粒子（在激发点）在单个点上采样，并在其空间范围内以光栅形式扫描粒子。 然而，系统的相通道引导用于“跳过”细胞样品的无害区域，以便快速检测。 
图 3：系统相位图像和拉曼光谱分析
图4：系统分析功能。
应用：
它可以表征和分析脂滴、线粒体和溶酶体等细胞器的位置、数量、环境和化学组成。
脂滴和线粒体的光谱变化可用于研究各种细胞器之间物质交换的机制。
可研究药物治疗下细胞中脂滴的形态和组成变化，为相关药物检测提供多模态信息和定量分析。
药物研究、脂质代谢研究等。
实验案例展示：
图5：脂滴的形态学和组成分析。
通过结合相位显微镜和拉曼光谱，我们能够以比传统点扫描拉曼显微镜快约600倍的速度快速量化固定细胞内脂滴的形态和组成。
图6：脂滴形态和化学成分的精确定量。
图7 脂滴的连续观察与分析3.
这些数字和数据均来自我们项目组的实验，并在分析化学上发表了1篇论文。
引文**：
1.rapidintracellulardetectionandanalysisof lipiddroplets'morpho-chemical compositionby phase-guided ramansampling
haozhang,jingdefang,yichuandai,yangpan,kaiqinchu,*andzacharyj.smith*，citethis:anal.chem.2023,95,13555−13565
细胞器特异性相差显微镜
该系统的功能是自动分析未标记细胞中多个细胞器的动力学参数和相互作用，实现整个细胞器动力学和相互作用的无标记可视化和分析。
该系统的四大特点：
线粒体和溶酶体可以通过单个2D强度图像进行识别和跟踪，图像采集由显微镜完成，动态识别全部由算法完成，具有高度的智能性。
使用低光子通量（比激光激发荧光照射的通量低约 40 倍）成像以及以最小干扰观察和自动分析线粒体裂变和融合速率可产生更接近理论上未观察到的状态的结果。
为了对结果进行定量分析，我们计算了几个指标，如结构相似性指数（SSIM）、多尺度SSIM（MS-SSIM）和皮尔逊相关系数。 通过对上述三个指标的定量分析，我们可以系统地评估所提出的算法或模型在细胞内溶酶体和线粒体位置和形态方面的准确性和可靠性。
我们还可以添加一个荧光通道，用单个标记（不需要多个荧光通道和多个染色）来分析细胞膜、细胞核、线粒体和蛋白质四种结构之间的相互关系。
应用：观察各种细胞器（包括线粒体、溶酶体、内质、脂滴等）之间的相互作用。
物理刺激（如低温、pH、饥饿等）和药物刺激（如FCCP、Erestin等）下线粒体、溶酶体和其他细胞器的应激状态和定量统计分析。 线粒体融合和融合、溶酶体运动和线粒体-溶酶体接触位点 （MLC） 的检测。 可观察对象：线粒体、溶酶体、内质、脂滴、囊泡、染色体、细胞核、细胞膜等。
实验案例展示：
图8 线粒体与DRP1的相互作用
我们的系统可以看到线粒体、DRP1 和内质动力学，类似于传统荧光成像中的动态。 （a） DRP1参与线粒体裂变; （b） DRP1引起线粒体收缩而不发生裂变; （c） DRP1向线粒体的定向迁移; （D） DRP1 遵循线粒体运动。
图 9：线粒体和 DRP1 卵子分布的细胞平面分析。
a） 细胞膜、细胞核和线粒体的鉴定;（b） 线粒体到细胞核的距离：线粒体到细胞核的相对距离; （c）线粒体向细胞核和细胞膜的分布具有一致的趋势; （d） 滚球法和阈值处理提取DRP1聚集体; （e） DRP1分布**软骨周，30%的DRP1与线粒体共定位; （e） 与 DRP1 的线粒体距离。
图10：线粒体动力学分析。
在图 A 的顶部，线粒体是 73 秒处的两个线粒体。 在底部，两个线粒体在 225 秒时融合成线粒体。 呈现了 10 分钟内的初始线粒体图像和运动。 d f 显示释放部分。 不仅可以看到起始位置（深蓝色圆点表）和结束位置（红点表），还可以看到这个时间段的运动轨迹e和f，裂变和融合过程在三帧中展开，裂变前后的两条线粒体线连接起来。
图11：溶酶体动力学分析。
A 和 B 是正常培养和饥饿细胞的图像。 可以观察到，在饥饿的细胞中，细胞器往往比正常细胞更多地聚集在细胞核周围。 可以跟踪每个溶酶体的运动轨迹，图11c中显示了正常细胞的单个示例。 然后，我们计算了每个溶酶体的平均置换（MSD）。 通过将MSD与异常扩散模型拟合，我们得到了异常扩散因子（在5秒内对10个随机选择的轨迹的分析结果如图11d和e所示）。 图 11f 显示了所有溶酶体轨迹的分布（每组 10 个细胞）。 与正常细胞相比，饥饿细胞中溶酶体的运动范围更有限 （1）。 鉴于溶酶体倾向于在饥饿细胞的细胞核周围聚集（图11B），预计它们的运动范围将更加有限。 此外，我们还可以通过单元级值（即单个单元内所有轨迹的平均值）来反映整个单元的状态。 结果如图11g所示。 可以看出，将饥饿细胞的值与正常细胞的值进行比较，这进一步证实了图11f中的结论。
这些数字和数据均来自我们项目团队的实验，其中1篇论文发表在ACS Photonics上。
引文**：
1.label-free analysis of organelle interactions using organellespecific phase contrast microscopy (os-pcm)jingde fang, hao zhang, yang pan, zachary j.smith，* 和 Kaiqin Chu*引用此内容：ACS Photonics 2023， 10， 1093 1103 如何防止学术欺诈私信我们的团队以了解更多信息