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产生甘油的念珠菌25S RNA甲基转移酶BMT5对乙酸胁迫耐受性的影响及其应用
作者：
刘周1,2， 卢新耀1,2， 宗红1,2， 朱戈斌1,2*
单位：
1 江南大学工业生物技术教育部重点实验室。
2 江南大学生物工程学院工业微生物与多元醇研究设计中心。
**项目：
国家自然科学计划（22278187）。
摘要>关键词
总结：挖掘功能基因和提高菌株对环境胁迫的耐受性对于有效利用纤维素水解产物生产乙醇至关重要。 念珠菌甘油素是一种具有多重抗逆性的工业菌株，通过基因组文库筛选获得RNA甲基转移酶基因CGBMT5。 CGBMT5在酿酒酵母中的表达提高了对乙酸的耐受性，胁迫下重组菌的乙醇得率为605 g l，增加 177%。在 cCGBMT5在甘油原中过表达后，乙醇产量增加176%，两种过表达细胞的产量、底物转化率和生产强度均得到改善。 此外，C将甘油素过表达菌应用于纤维素水解产物发酵，乙醇收率提高71转化率提高 7% 和 65%0%，生产强度增加1557%。在醋酸胁迫下，过表达细菌中脂质过氧化水平降低，过氧化氢酶（过氧化氢酶）和超氧化物歧化酶（SOD）活性增加。 转录分析表明，PFK1和ARG3基因上调，GPD1和CoX3基因下调，提示CGBMT5可能通过降低脂质过氧化水平、增加SOD和CAT活性、影响葡萄糖代谢和精氨酸合成来促进菌株的乙酸耐受性和发酵能力。 本研究为酵母的胁迫耐受机制和纤维素乙醇技术的发展提供了新的生物材料。
关键字：产生甘油的酿酒念珠菌; 基因筛查; 环境压力; 纤维素水解产物; RNA甲基转移酶。
主要结论：
1.CGBMT5对酿酒酵母耐醋酸及发酵性能的影响
经过基因组文库筛选和测序比较，获得了促进乙酸耐受性的基因CGBMT5。 与对照细菌（s.）酿酒酵母 p414-kan）。Cerevisiae P414-kan-CGBMT5在85 mmoll L乙酸下生长较好（图1-A），滞后期缩短约12 h，乙醇产率为60 h5 g l，增加 177%；每个晶胞的乙醇产率129 克升，27 升7%；转化率 416%，同比增长17%8%，生产强度提高176%，生物量无显著变化（图1-b）。 这些结果表明，CGBMT5可以改善醋酸胁迫下酿酒酵母的生长和乙醇发酵性能。
A-85 mmolL醋酸点板应力结果; 乙醇发酵性能 B-85 mmoll l 醋酸胁迫。
图1 CGBMT5 与 S酿酒酵母对醋酸耐受性和发酵性能的影响。
figure 1 effects of cgbmt5 on acetic acid tolerance and fermentation performance of s. cerevisiae
2.CGBMT5 对 C 的过表达甘油素胁迫耐受性的影响
120 mmol乙酸在C中应激CGBMT5在甘油原中过表达，过表达菌株滞后时间缩短24 h，乙醇得率为62 h7 克升，增加 176%，每晶胞乙醇收率为123 g l，增加 171%；转化率 461%，增加176%；生产强度增加477%，最终生物量无显著差异（图2-a）。 结果表明，在CGBMT5在甘油原中的过表达改善了120 mmoll 乙酸胁迫下的乙醇发酵性能。
甘油是乙醇发酵的副产品，收率为51 g l，1 单位细菌甘油产量0 g l，与对照无显著差异，生产强度增加205%（图2-b）。 结果表明，在醋酸胁迫下，CGBMT5的过表达不能增加菌株甘油的积累。
a- c.甘油剂乙醇发酵; 甘油产量，b-乙醇发酵的副产品。
图2 CGBMT5的过表达与C的关系甘油素对乙醇发酵性能的影响。
fig.2 effect of overexpression of cgbmt5 on the ethanol fermentation performance of c. glycerinogenes
为探究过表达菌株耐酸的机制，进一步分析了过表达菌株的细胞膜脂质过氧化水平以及CAT和SOD的酶活性（图3）。 在正常条件下，对照菌株和过表达菌株之间的脂质过氧化水平相似。 然而，在醋酸胁迫下，过表达菌株的脂质过氧化水平降低181%（图3-A），表明CGBMT5可以通过降低过表达菌株中的膜脂质过氧化水平来调节细胞以应对乙酸应激; 过表达菌株的CAT和SOD活性分别为9%2 U mg 蛋白质，347 u mg 蛋白质（图 3-b），增加 736% 和 535%，表明CGBMT5过表达后菌株耐乙酸性的变化与抗氧化酶活性的增加有关。
a-c.甘油素脂质过氧化水平; b-c.甘油素过氧化物酶活性。
图3 CGBMT5的过表达与C的关系甘油素、脂质过氧化水平和过氧化物酶活性的影响。
fig.3 effect of overexpression of cgbmt5 on lipid peroxidation level and peroxidase activity of c. glycerinogenes
注：图中的应力条件均为120 mmol l乙酸。
为研究CGBMT5对菌株细胞内代谢的调控机制，检测甘油-3-磷酸脱氢酶基因（GPD1）、鸟氨酸氨基甲酰转移酶基因（ARG3）、质膜P2 H+-ATPase基因（PMA1）、磷酸果糖激酶基因1（PFK1）和细胞色素C氧化酶亚基基因（COX3）的转录水平。 在乙酸胁迫下，这些基因部分上调（图4），其中Arg3的转录水平增加了4糖酵解途径的关键酶基因PFK1上调8倍5次。 这些结果表明，CGBMT5的过表达可能影响上述酸胁迫反应基因的转录。
图4 乙酸耐受相关基因的转录水平。
fig.4 transcription levels of genes related to acetic acid tolerance
3.过表达菌株用纤维素水解产物发酵乙醇
CGBMT5过表达菌株C将甘油素δura5 purgap-cgbmT5应用于纤维素水解产物中发酵乙醇，过表达菌株生长优于对照，生物量增加676%；乙醇生产 218 g l，增加了 717%；每个晶胞的乙醇产量29 克升，26 升1%；转化率为363%，同比增长65%0%，生产强度增加1557%。总之，在 CCGBMT5在甘油素菌株中的过表达可以显著提高菌株对多种胁迫和复杂环境的耐受性，从而提高纤维素水解产物的乙醇发酵性能。
图5 用乙醇、纤维水解物发酵过表达CGBMT5菌株。
fig.5 cgbmt5 overexpressed strain ferments ethanol with fiber hydrolysateh
本研究证实，CGBMT5 通过影响过氧化物酶 SOD 和 CAT 的活性以及影响 C 来减轻 ROS 对细胞造成的损害甘油原δura5酸胁迫反应基因PFK1、GPD1、COX3和ARG3的转录通过促进细胞内精氨酸合成途径和上调磷酸果糖激酶PFK1，提高了菌株对乙酸的耐受性和乙酸胁迫下的乙醇发酵性能，提高了纤维素水解产物乙醇的晶胞产量和底物转化率，为酵母胁迫耐受性的研究和开发提供了新的生物材料纤维素乙醇技术。
认识团队。 江南大学工业微生物实验室是由老一辈科研人员建立和发展起来的，是我国最早开展工业微生物技术研究的单位之一（1963年）。 主要研究方向为工业酵母念珠菌甘油素的抗逆机理、底盘改性及其在高附加值化学品合成中的应用。 课题组先后获得“国家发明二等奖”、“中国轻工业科技进步一等奖”、“中国粮油学会科学技术奖一等奖”、“中国商业联合会科技进步一等奖”。
组长
诸葛斌，江南大学生物工程学院教授、博士生导师，主要研究方向为工业酵母的抗逆机理及底盘应用。 江苏省“六大人才峰”高层次人才，先后获得国家、省部级科技进步一等奖3项、三等奖1项、市级1项，出版国内外学术期刊近200种，主编、副主编或合编5部（国家“十一五”规划2项），发明专利21项。 主持自然**等国家级项目6项，省部级项目3项，市级、企业项目多项。
引文格式
刘周、卢心瑶、宗红等 甘油念珠菌25S RNA甲基转移酶BMT5对乙酸胁迫耐受性的影响及其应用[J].食品与发酵工业，2024,50（01）：1-6.
*供稿 |作者：