近年来，抗体在各种疾病的新**研究中显示出巨大的潜力。 在癌症**领域，对抗体-药物偶联物 （ADC） 的研究正在蓬勃发展。 ADC利用单克隆抗体（mAb）的特异性，以靶向方式将细胞毒性药物递送至表达特定标志物或抗原的肿瘤细胞，从而实现靶细胞的死亡。 乳腺癌药物Kadcyla是一种ADC药物，由靶向HER2的曲妥珠单抗（赫赛汀）与细胞毒性药物异美他嗪（DM1）联合组成。
其作用机制（MOA）如下： DM1定向转运至HER2阳性细胞 曲妥珠单抗介导的HER2信号通路抑制 抑制HER2细胞外结构域从细胞膜脱落 抗体介导的ADCC。
在乳腺癌药物KADCYLA的主要作用机制中，抗体有效地与细胞表面的HER2结合并指导药物的内化，导致DM1分子的细胞内释放。 因此，ADC药物的结合、内化和毒性的实验研究是必不可少的。 这些过程的动态可以通过Incucyte实时活细胞分析系统进行捕获和分析。
Incucyte实时活细胞分析系统。
Kadcyla结构示意图。
1.抗体内化。
方法：Incucyte Human FabFluor-pH Antibody Labeling DYE 一步法特异性标记人 IgG 的 Fc 片段，对 pH 敏感，可达到以下效果：标记的抗体复合物一旦与特定位点结合，就会被细胞内化并进入低 pH 溶酶体环境。 随着pH值的变化，染料会产生荧光信号，当使用Incucyte活细胞分析系统时，可以可视化抗体的内化。
在添加标记抗体药物后 12 小时，Kadcyla 和曲妥珠单抗在 HER2 阳性乳腺癌细胞 AU565 中显示出更高水平的内化（与 IgG 阴性对照组和 HER2 表达低的 MDA-MB-231 细胞组相比）。 6 g ml Kadcyla组在<6 h时达到平台期。 Kadcyla和曲妥珠单抗的24小时EC50值分别为0%38 μg/ml，0.22 g ml，表现出相似的结合特异性和内化作用。 这些观察是通过使用活细胞分析系统和活细胞成像仪进行的。
2.细胞增殖。
方法：Incucyte Nuclight Green Lentivirus试剂在AU565细胞中稳定表达绿色核荧光信号。 赛多利斯的 Incucyte 活细胞分析系统可实时捕获图像并分析细胞核数量，以表征细胞增殖状态。
Kadcyla 中的 DM1 是一种微管蛋白抑制剂，可抑制微管的组装，导致细胞周期中断，从而导致有粒体**停止，然后死亡。 当 Kadcyla 被内化为溶酶体时，DM1 被切割并释放到细胞中，并在细胞中发挥作用。
药物作用 72 小时后，kadcyla （15 g mL）显示不健康的细胞形态，增殖受到显着抑制（与IgG阴性对照组和曲妥珠单抗组相比）。Kadcyla对细胞增殖的抑制作用的IC50为024 g ml，与内化滴度相似，并显示出与喜树碱相当的最大细胞杀伤力。 使用细胞健康指示剂 incucyte 膜联蛋白 v 染料 （030 g ml，数据未显示）测定Kadcyla细胞凋亡滴度一致。
3.细胞周期。
方法：Inucyte Cell Cycle Lentivirus Agent在Au565细胞中稳定表达G1和S G2 M期荧光指示剂，且该试剂不影响细胞的正常功能。 细胞核在 S g2 m 相处发出绿色荧光; 细胞核在 M 至 G1 相中是无色的; 细胞核在 G1 期发出红色荧光; 在 G1 至 S 期，细胞核发出黄色荧光（绿色与红色叠加）。 Incucyte 活细胞分析系统实时捕获图像，Incucyte Cell-by-Cell Module分析不同颜色的细胞核数量，以表征细胞周期状态。
在正常情况下，AU565细胞周期不同阶段的细胞百分比为绿色（S g2 m，40 3%），红色（G1,24 2%），黄色（G1 S，15 2%）或无色（M g1,20 4%）。 在Kadcyla（3g ML）处理的AU565细胞的前24小时内，红细胞减少（下降至13%），无色细胞增加（高达27%），表明M G1期循环停止。 在36小时时，图像主要显示绿色细胞（24%）和非荧光细胞（52%），这些细胞及其越来越圆的形态表明周期停滞发生在有丝分裂阶段附近。 48小时后，细胞在形态上似乎不健康，正在死亡。 同种型比较剂IgG或曲妥珠单抗（数据未显示）影响不大。
4、adcc
方法：将稳定表达绿色核荧光信号的AU565靶细胞与NK细胞按5：1的功效比培养，不同浓度的Kadcyla加入不同样品组。 将 Incucyte 膜联蛋白 v nir 染料添加到培养基中以表征细胞凋亡信号。 Incucyte 活细胞分析系统实时捕获图像以分析靶细胞数量和细胞凋亡信号，以表征 ADCC 效应。 为了证明KADCYLA的综合功效，将其通过常规ADCC杀死靶细胞的能力（与直接杀伤相结合）与其在单次培养中的直接细胞毒性作用（单一培养）进行了比较。
在单一培养和共培养孔中，绿色荧光均存在与浓度相关的降低，表明 Kadcyla 处理的靶细胞死亡。 从图像中可以明显看出，在NK存在的情况下，额外的ADCC作用比单独的直接细胞毒性作用更强。 ADCC杀死靶细胞的速度更快，强度约为25倍（EC50：直接细胞毒性0.）。27 g ml，ADCC 为 0011 μg/ml）。膜联蛋白V信号显示出类似的数据。 96 h数据显示，ADCC共培养模型提高了靶细胞清除率，这与Kadcyla对肿瘤细胞清除率的高临床疗效一致。
综上所述，Incucyte活细胞分析系统是使用KADCyla作为ADC药物的一个例子，它可以简单明了地可视化和定量KADCYLA的抗体内化、细胞增殖、细胞周期和ADCC效应。
Kadcyla 与表达 HER2 的细胞特异性结合，并以与曲妥珠单抗相似的效率和效力内化。
与曲妥珠单抗不同，Kadcyla一旦内化，就会通过释放细胞毒性负荷DM1（一种有效的微管蛋白抑制剂）导致细胞定向死亡。
Kadcyla介导的ADCC活性和直接杀伤的联合作用提高了肿瘤细胞清除的效率。
为什么选择Incucyte实时活细胞分析系统？
选择Incucyte实时活细胞分析系统的原因归结为其多种优势：
该系统允许在培养箱内连续观察数周，拍摄间隔短至几分钟，大大减少了手动操作的需要，并防止过度干预可能对细胞造成伤害。 这保证了关键信息的捕获，例如文章中提到的细胞周期动力学的监测，从而可以目视观察细胞阻滞。
Incucyte 配备 6 个位置，每个位置都可以独立编程，并且与各种板和培养皿兼容，用于高通量实验。 无论是免疫抑制剂、疗效靶标比等多种实验组合，Incucyte都能一次性完成所有实验组的检测。