抗体药物因其高特异性、显著的疗效和优越的药代动力学而在生物制药市场中发挥着重要作用。 根据 Frost & Sullivan** 的数据，到 2030 年，全球抗体药物市场预计将增长到 4431 亿美元。 随着抗体药物需求的逐步扩大，抗体发现和筛选技术的发展势在必行。 目前，抗体技术最常见的应用包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术和B细胞克隆技术。 每种技术都有自己的优点，在本期中，我们将重点介绍单B细胞抗体技术。
单细胞抗体技术是指利用一个B细胞中只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，而一个B细胞只产生一种特异性抗体特征，从免疫动物组织或外周血中分离出特异性B细胞，然后通过单细胞PCR技术从B细胞中分泌出单抗体，扩增重链可变区和轻链可变区区域DNA序列，最后在哺乳动物细胞中表达，获得具有生物活性的单克隆抗体。目前，单B细胞抗体技术已广泛应用于病原微生物感染、肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植等领域，并显示出独特的优势和良好的应用前景。
传统的杂交瘤抗体具有较长的发育周期，包括免疫接种，通常需要8个月左右。 而且，由于杂交瘤融合率的限制，整个B细胞群中只有一小部分B细胞完全融合，获得的阳性克隆很少，不适合对大型抗体库进行综合筛选。 对于噬菌体展示技术来说，尽管其文库容量很大，但重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的配对通常依赖于随机组合，而大部分形成是非自然的VH-VL抗体配对。 单B细胞抗体技术作为继杂交瘤技术和噬菌体展示技术之后的新一代抗体开发技术，具有开发周期长、阳性克隆多、全源源、细胞体积小等优点。 最重要的是，通过单细胞抗体技术获得的抗体确保了轻链和重链的自然配对，这在抗体开发中至关重要。
单B细胞抗体技术全过程主要有五个步骤，包括B细胞富集、单B细胞筛选、抗体基因测序分析、重组抗体表达、抗体功能验证等。
figure 1. the process of single b cell antibody technology
B细胞富集，B细胞一般**在外周血中，B细胞可通过静脉采血和离心分离白细胞层获得。
单B细胞筛选，也称为单B细胞分离或阳性克隆筛选，是指从混合B细胞群中分离出单B细胞，是单B细胞技术中最关键的步骤。 根据样品类型，单B细胞分离可分为随机分离和抗原特异性分离。 随机分离是指B细胞的分离，常用的分离方法包括显微操作、激光捕获显微切片和荧光激活细胞分选。 这种类型的分离适用于具有高浓度抗原特异性抗体的样本（例如，来自疫苗接种者或患者的血液样本）。 抗原特异性分离是指抗原特异性B细胞的分离，常用的分离方法包括荧光标记抗原多参数细胞组分、抗原标记磁珠分选、微雕法、细胞微阵列等。 这种类型的分离适用于抗肿瘤抗体和自身免疫抗体等特异性抗体含量较低的情况。
获得单个B细胞后，对其抗体基因进行测序和分析。 如前所述，此步骤可以通过单细胞PCR技术来扩增重链和轻链可变区DNA序列，然后进行测序。 测序后，可以通过生物信息学对测序数据进行分析，包括基因序列比对、突变鉴定和亲和力评估。
通过上一步对抗体基因的测序分析，通常选择亲和力较好的抗体基因进行重组抗体表达。 具体选择需要根据您自己的实验设计。 在生物制药研究领域，常用用于重组抗体表达的表达系统是哺乳动物细胞表达系统。
抗体基因重组表达后，需要进一步验证其功能，以确定其生物活性和抗原结合能力，常用的验证方法包括流式细胞术、酶联免疫吸附剂和免疫组化。
基于单B细胞技术的创新兔单克隆抗体发现平台，专注于克隆抗体基因前的单B细胞体外培养。 与传统的单细胞PCR相比，Dima克隆的数百个B细胞的抗体基因来源于单个亲本B细胞。 这种方法显著提高了克隆的成功率，使Dymad能够从免疫动物身上获得更多的阳性先导抗体序列。 正常情况下，一只兔子的B细胞总数可以达到3-5x10 8，从中获得的分泌特异性抗体B细胞克隆总数可以达到数万个。 平台利用兔单克隆抗体的优势，提供从抗原合成到抗体功能验证的一站式服务，时间短，可直接获取抗体基因序列和功能蛋白抗原。
平台流程
figure 2. the process of dimab® platform
个案研究
BCMA先导抗体分子开发与CAR-T应用。
GPRC5D先导抗体分子开发及CAR-T应用。
此外，针对热门药物靶点，迪马还准备了B细胞种子库。 DIMAB B 细胞种子库由从免疫兔中分离的 B 细胞构建而成，这些 B 细胞已通过 ELISA 和 FACS 预先验证，可特异性结合抗原蛋白。 DIMAB B 细胞库主要用于筛选先导抗体分子。 筛选出的先导分子具有多样的CDR序列和良好的成药性。 目前对应种子库有靶点，最快35天即可获得先导抗体。 截至2023年底，近五年来，电马已完成407个新靶点B细胞种子库的制备和275个药物靶点先导抗体分子的开发。 除了兔单克隆抗体，迪马还搭建了鼠单克隆抗体、绵羊单克隆抗体和纳米抗体的开发平台。