自 1979 年首次发表描述蛋白质印迹的出版物以来，这种免疫检测技术已广泛用于改变从细胞或组织中提取的复杂混合物中的特定蛋白质。 蛋白质印迹有三个基本要素：1 按大小分离蛋白质，2 转移到固体支持物，3 用适当的一抗标记目标蛋白质，然后可视化（通常使用偶联的二抗）。 随后工具和技术的改进，以及高灵敏度荧光标记物的发展，有效地提高了检测限，使科学家能够探测组织特异性的正常和疾病。 然而，科学家在使用定量蛋白质印迹法来识别蛋白质水平的变化时经常会遇到一些困难。 这是因为许多蛋白质在组织中以及在不同的生理和病理条件下表现出不同的表达模式。
虽然蛋白质印迹可能是最常用的免疫学应用，但仍有一些关键的技术问题可能被忽视了很长时间。 例如，分离或分离方案是否会影响蛋白质的完整性或其翻译后修饰？是否有可能区分蛋白质的解释或聚集与生物过程的相关产物当结果是多个波段时，如何确定哪些是结果、变化、伪影？
定量蛋白质印迹法可用于比较一组样品中靶蛋白的相对量，这些样品可以代表不同的个体、条件、疾病状态或其他生物学变量。 为了准确识别和测量多个样品中的总蛋白水平，科学家可以使用“上下对照”作为内标。 该对照是指添加针对蛋白质的一抗，该蛋白质假定存在于所有样品中，并且其相对丰度不受生物学变异或实验条件的影响。 蛋白质靶标通常是上样对照的良好候选者，它们是普遍表达的“管家”基因产物。 假设不同样品通道之间的上样量控制相同，则上样控制可用于量化所有孔中的样品量，以标准化结果。 使用上样控制还可以防止“边缘效应”，这在使用大量泳道时很常见，并且外泳道中的蛋白质转移到更靠近框架的涂片中，从而导致泳道上的染色更强烈。 上样对照可用于显示上样蛋白量是否发生变化，并解释目标条带中观察到的变化。 如果使用得当，上样对照可确保蛋白质得到正确定量，尽管蛋白质印迹所有泳道的上样量略有不同。
肌动蛋白和微管蛋白已被用作上样对照，因为它们的表达在大多数模型系统中是相对组成型的。 然而，一些出版物质疑使用肌动蛋白作为标准负荷对照，理由是肌动蛋白和微管蛋白水平组织之间存在差异，并且它们的表达可能受到病理条件的影响。 这些作者建议将总蛋白分析作为定量蛋白质印迹的替代技术，并建议在研究所研究基因表达模式后应谨慎使用“管家”基因产物。 尽管如此，肌动蛋白和微管蛋白作为内控抗体具有一定的优势：它们高度保守，表达水平高，并且在大多数实验条件下表现出良好的稳定性。 需要注意的是，必须根据所研究的特定组织或细胞类型来选择对照，并且可能需要经验测试来验证上样对照的均匀性。
为了克服蛋白质印迹的变异性并减少数据解释中的错误，以下一些预防措施可能会有所帮助。
采用表达稳定、受实验条件影响最小的内部上样对照。
选择针对样品组成行中已知表达的蛋白质的上样对照抗体。
第二个加载对照用于确认从第一个对照获得的结果。 它对于新的或新颖的样品特别有价值。
上样对照应涵盖较宽的分子量范围，以便所选对照与目标蛋白的分子量相似。 这确保了在印迹上可以轻松区分目标条带和对照条带。
上样对照抗体通常可检测大量表达的管家蛋白，导致信号饱和，尤其是在使用化学发光检测方法时，过饱和可能导致上样对照条带无法作为参考，并可能隐藏目标蛋白量的样品间差异。
引用
1. renart j, reiser j, stark gr. 1979. transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-**and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.. proceedings of the national academy of sciences. 76(7):3116-3120.
2. dittmer a, dittmer j. 2006. βactin is not a reliable loading control in western blot analysis. electrophoresis. 27(14):2844-2845.
3. eaton sl, roche sl, ll**ero, hurtado m, et al. total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent western blotting. plos one. 8(8):e72457.
4. li r, shen y. 2013. an old method facing a new challenge: re-visiting housekeeping proteins as internal reference control for neuroscience research. life sciences. 92(13):747-751.
5. gorr ta, vogel j. 2015. western blotting revisited: critical perusal of underappreciated technical issues. prot. clin. appl.. 9(3-4):396-405.