中华人民共和国农业行业标准
ny/t 4307-2023
葛根中黄酮类化合物的测定
高效液相色谱法串联质谱
determination of fl**onoids in the root of kudzu vine-
high performance liquid chromatography-mass spectrometry (hplc-ms)
前言
本文件符合GB T 11-2020《标准化工作指南第1部分：标准化文件的结构和起草规则》。
请注意，本文档的某些内容可能与专利有关。 本文件的发布者不承担识别专利的责任。
本文件由农业农村部农产品质量安全监督司提出。
本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会监督。
本文件起草单位：北京工业大学、浙江省农业科学院、广西壮族自治区农业科学院。
本文件主要起草人：张芳、齐培培、王颖、王玉婷、支美丽、裴鲁豫、李一山、闫华兵、尚晓红。
范围
本文件规定了一种高效液相色谱-串联质谱法定量检测葛根中黄酮类化合物的方法。
本文件适用于葛根素，3'- 羟基葛根素，3'- 测定11种黄酮类化合物，包括甲氧基葛根苷元、黄豆苷元、黄豆苷元、染料木黄酮、毒刺黄精、花青素、异甘草甜素和鹰嘴豆芽A。
规范性参考文献
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GB T 6682 分析实验室用水规范和风险试验方法。
术语和定义
本文档中没有需要定义的术语和定义。
原则
采用乙醇水溶液超声提取葛根样品中的黄酮，采用高效液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
试剂和材料
除非另有说明，否则所有试剂均为分析纯度。
5.1 试剂。
5.1.1 水：GB T 6682,1 级。
5.1.2甲醇（CH40）：色谱纯。
5.1.3甲酸（CH2O2）：色谱纯。
5.1.4乙醇（C2H6O）：分析纯。
5.2.试剂制备。
5.2.1 10%甲醇溶液：取10ml，甲醇（5.）1.2）、加水（5.）1.1） 将体积设置为 100 毫升并充分混合。
5.2.2 30%乙醇溶液：取30ml，乙醇（5.）1. 4).加水 （5.）1.1） 将体积设置为 100 毫升并充分混合。
5.3个标准。
黄酮标准品：相关资料见表1，纯度不低于98%。
5.4.标准溶液的配制。
5.4.1.黄酮标准贮备液：精密称取11种（表1）待测物质的标准品，用甲醇（51.2）溶解后，加入10%甲醇溶液（52.1）定量稀释制成高浓度单标储备液。将一定量的 11 种单一标准储备溶液移液到 25 ml 容量瓶中，加入 10% 甲醇溶液 （52.1）定容，制成10mg l母液作为标准储备液。防止 light-18 并保留以备后用。
5.4.2.黄酮混合标准溶液：与10%甲醇溶液（52.1：母液10mgl（54.1）稀释配制不同浓度的混合标准溶液，绘制标准曲线。应使用混合标准溶液并配制。
仪器设备
6.1 超高效液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。
6.2、电鼓风干燥箱：温度50°C330，功率3°C1 kw。
6.3 超声波清洗机：超声波输入功率 200 W。
6.4.离心机：转速不低于7 500转分。
6.5、超细水冷破碎机：细度20目180目（085mm~0.09mm），功率 25kw。
6.6 平衡：电感 0001 g 和 0000 1 go
试样制备
7.1.试样制备。
将新鲜葛根洗净除去沉淀物，去皮，用切片机切成2毫米的薄片，放入托盘中，在70度的烤箱中干燥至恒重。 然后，葛根样品在分级超细水冷研磨机中粉碎，并将其全部包装到干净的容器中，以便立即进行测试。 如果需要更长的储存时间，请密封并标记样品并将其储存在 -18 以下。
7.2 标本提取。
称重 05 g （精确到 0.）000 1g），置于50ml离心管中，加入25ml 30%乙醇溶液（52.2）室温下超声提取45分钟。 以7500r分钟离心5分钟，并将上清液转移到50ml容量瓶中。 然后用30%乙醇溶液（52.2）洗涤2次，每次用量约5毫升。 在相同条件下离心5分钟，合并上清液，30%乙醇溶液（52.2） 大小为 50 毫升。 加载前，022 m 有机相过滤膜过滤 （5.）5)。
测定
8.1 超高效液相色谱参考条件。
8.1.1 根色谱柱：ACE Excel C18 色谱柱 （100 mm2.）1mm×1.7 m） 或同等水平。
8.1.2.流动相A：甲醇（5.）1.2)。
8.1.3流动相B：01%甲酸水溶液，取01毫升甲酸（5.）1.3） 加水 （5.）1.1） 将体积设置为 100 毫升并充分混合。
8.1.4、柱温：40°C。
8. 1.5 流量：03 ml/min。
8.1.6. 注射量： 10 l.
8.1.7 流动相：梯度洗脱过程如表2所示。
8.2质谱参考条件。
8.2.1、扫描方式：正负离子扫描。
8.2.2电离电压：4 000 V。
8.2.3、毛细管温度：250°C。
8.2.4、碰撞气体：氩气（纯度99.）99%），压力为270 kPa。
8.2.5、雾化气体：氮气（纯度97%以上），流量3 0 l/min。
8.2.6.辅助气体：氮气（纯度97%以上），流量100 l/min。
8.2.7、检测方式：多反应监测（MRM）。
8.2.8.黄酮保留时间和监测离子对信息见附录A
3.3.测试样品的测定。
在仪器的最佳条件下，将黄酮类化合物与标准溶液（54.2）用葛根素等11种黄酮样品（72）在机器上测量。混合标准溶液中11种黄酮类化合物的总离子色谱图和各组隔膜的色谱图见附录A。
8.4. 定性测量。
如果样品溶液中检测到的峰的保留时间与基质标准溶液中目标色谱峰的保留时间一致（变异范围为2.），则在相同的测试条件下测定样品和混合标准品。5%），将样品溶液的质谱离子对相对丰度与相同程度的基质标准溶液质谱离子对的相对丰度进行比较，相对离子丰度的相对偏差不超过表3规定的范围，即可确定样品中是否存在该组分。混合标准溶液中各黄酮类化合物的离子色谱图见附录B。
8.5.定量测量。
以不同浓度的混合标准溶液浓度为横坐标，以色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线相关系数应不小于099。样品溶液和标准溶液中分析物的响应值应在仪器的线性范围内。 如果超过线性范围，则应相应稀释样品溶液和基质匹配的混合标准系列溶液并重新测量。 在单点校准定量中，样品溶液中分析物的浓度与溶剂混合标准溶液的浓度相差不超过30%。 标准添加法以添加标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，外推至浓度轴。
8.6 结果计算。
采用液相色谱质谱数据处理软件或按公式计算试样中检测目标的量，按公式（1）计算。
其中： - 样品中黄酮类化合物含量的值，单位为毫克/千克（mg kg）;
a——样品中黄酮类化合物的峰面积;
s - 标准溶液的浓度值，单位为毫克/升（mg l）;
v - 固定体积的体积值，单位为毫升（ml）;
f——稀释因子;
AS—标准品中黄酮类化合物的峰面积;
m – 最终溶液所表示的试样质量的数值，单位为克 （g）。
注：空白值应从计算结果中减去，测量结果表示为平行测量的算术平均值，保留3位有效数字。
精度
9.1 重复性。
在重复性条件下获得的 2 次独立测量结果之间的绝对差异不大于 2 次测量的算术平均值的 15%。
9.2 再现性。
在重现性条件下获得的 2 次独立测量结果之间的绝对差异大于 2 次测量的算术平均值的 15%。
检测限和定量限
黄豆苷元，葛根素，3'- 甲氧基葛根素和花青素的检出限为001mg kg，定量限为003 mg/kg；秸秆秆，3'- 甲氧基葛根素和异甘草甜素最容易被检测到02mg kg，定量限为007 mg/kg；黄豆苷元、染料木黄酮、染料木黄酮和鹰嘴豆A的检出限为003mg kg，定量限为01 mg/kg。
*从：