小耳畸形是耳廓的先天性发育不良，临床上通常表现为耳廓畸形，常合并外耳道闭锁和中耳畸形，通俗地说，即比对侧耳小，缺乏正常的耳形态，可称为小耳畸形。 小耳畸形可分为非手术型和手术型。
根据3D科学谷的市场观察，医学界已经利用3D打印技术制造了外科小耳畸形方案中外耳重建手术所需的植入物。 例如，临床阶段的再生医学公司 3DBIO Medical 和 2022 年的小耳畸形研究所使用 Aurinovo 植入物进行了人耳重建，Aurinovo 植入物是一种研究性、患者匹配的 3D 生物打印生物打印耳植入物。
EngineeringForLife最近推出了一种新颖的耳廓生物制造方法，该方法将3D打印模具与先进的铸造策略相结合。 Root报道，由于解剖组织的复杂和分层结构，建立**小耳畸形的多组织耳廓移植是一个挑战。 为此，苏黎世联邦理工学院的Marcy Zenobi-Wong和他的团队提出了一种利用洗脱琼脂糖的方法模具进行异质性、多层和人体规模的组织移植用于3D生物制造的新型铸造技术。本期内容提要山谷。 列该技术将简要分享。
这些模具是通过将琼脂糖浇铸到定制的 3D 打印容器（称为元模具）中生成的，经过优化以促进基于几何和拓扑约束的水凝胶浇铸过程。 浇注产生高分辨率 （50 m），并允许在移植物上浇注更多的水凝胶层。 多层耳廓结构是在软骨核心上制造的，软骨核心由透明质酸-海藻酸盐双重网络和相邻的明胶基真皮层组成。 相邻层之间的键合是通过层间残余官能团的正交物理和酶交联来实现的。 针对每层软骨和血管前真皮组织优化了材料组成和培养时间。 为了证明该技术在人类大小移植物的生物制造中的可扩展性，铸造了双层人类大小的耳朵。 一般来说，这种新的铸造技术它为复杂组织移植物的制造提供了一种很有前途的方法，克服了其他传统生物制造方法的局限性。
该研究于2024年10月28日发表在Advanced Healthcare Materials上，标题为“Biofabrication of Heterogeneous， Multi-Layered， and Human-Scale tissue Transplants Using Eluting Mcasting ”。
图1 实验概览。
该研究介绍了一种用于非均匀双层结构生物制造的新型铸造技术，包括无血管软骨核心和预血管化真皮。 所提出的技术基于使用 DLP 技术 3D 打印的元模具生成多部分琼脂糖模具。 使用低浓度琼脂糖（3% W V）制备琼脂糖霉菌，并预装氯化钙（CaCl2）和过氧化氢（H2O2），分别用于海藻酸盐的离子交联和酪胺修饰的透明质酸和明胶-水凝胶的共价交联。 然后将细胞水凝胶前体溶液浇铸到连续琼脂糖模具中，以精确生成多层水凝胶。 为了证明这种技术的可扩展性和潜力，本研究制造了一种双层、人类大小的耳移植（图1）。 耳软骨的核心结构是通过将人耳软骨细胞封装在由高分子量透明质酸酪胺 （HA-TYR） 和藻酸盐 （ALG） 制成的水凝胶中而形成的。 通过将 Huvecs 和原代人真皮成纤维细胞封装在明胶酪胺 （gel-tyr） 水凝胶中形成模拟真皮层。 这种生物正交策略保持了透明软骨的无血管性质，同时还支持与真皮组织层相邻的微毛细血管网络的发展。 该技术可生产针对特定患者的模具设计，以及该技术的多层次和可扩展方法，使洗脱模具成为制造具有各种细胞密度的人体大小的组织和器官的有吸引力的解决方案。
图2 模具制造。
一旦找到最佳去除方向，就会产生一组称为元模具的塑料模具（图2A），其中注入熔融琼脂糖聚合物溶液并冷却至室温以创建琼脂糖模具（图2B）。 接下来，从元模具中提取琼脂糖霉菌并组装（图2C）。 使用注射器将充满细胞的水凝胶前体溶液注入组装好的模具中（图2D）。 根据模具设计，可以很容易地将两个模具分开，以可视化铸造植入物（图2e）。 后续层可以以相同的方式添加到植入物中（图2F-L）：对新层重复此过程，从顶部开始，分离方向保持不变。 要铸造该层的第二部分，请取下底模，更换新模具，然后重复该过程（图2F-L）。
图3 模拟的100 mmCaCl2和001% H2O2 从琼脂糖霉菌扩散到浇注水凝胶的有限元分析。
为了估算每层交联所需的时间，我们在 COMSOL multiphysics 中建立了有限元分析 （FEA） 仿真（图 3）。 图 3a 分别显示 100 mMcAc2 和 0 mMCAC201% H2O2 随时间扩散。 模拟估计 100 mCaCl2 完全扩散到铸件软骨结构中的时间为 30 min，001%H2O2的时间为20 min。 图3b显示了第二层铸件的相同模拟。 在这种情况下，铸件材料的交联只需要 H2O2。
图4 软骨对照组的体外表征。
图 4A、B 显示了条件 2 在 49 天内有 30 106 个细胞的软骨生成潜力。 在所有时间点，细胞保持超过93%的存活率（图4C）。 使用基于免疫组织学染色的强度定量，可以对样品中的糖胺聚糖（GAG）和胶原沉积进行半定量评估（图4D）。 压缩测试显示，在49天的孵育期内，样品的刚度稳定且显着增加（图4E）。 RT-qPCR数据证实，在选定的时间点，I型胶原（col1a1）基因的表达没有显着增加（图4F）。 相比之下，软骨细胞外基质 （ECM） II 型胶原 （COL2A1） 和聚集聚糖 （ACAN） 的标记基因随着时间的推移显示出显着的上调（图 4F）。
图5 血管化真皮对照的体外表征。
3% 和 45%的条件允许在3D基质中快速发展血管网络（图5A）。 无限制压缩测量表明，弹性模量随着聚合物含量的增加而继续增加，在6%凝胶-酪氨酸下为1709 102 pA（图5b）。 在3%和6%的凝胶-tyr条件下，血管形成面积和总血管长度存在显着差异（图5C）。 使用 CD90（thy-1） CD31 共染色证实了 CD90+ 成纤维细胞和微毛细血管的共定位（图 5D）。 长期积累培养物导致高度互连的毛细管网络的形成（图5E）。 7天后，管腔形成清晰可见（图5F）。
图6 人形多层耳朵的铸造。
为了证明元模型技术的可扩展性和潜力，我们制作了一个两层，人类大小的耳移植技术。从耳软骨核心开始，从内向外铸造（图6A）。 CaCl 2 和 H 2 O 2 O 2 通过从琼脂糖模具扩散到注射的聚合物溶液中 30 分钟来引发交联（图 6A）。 在这两个步骤之间，通过让H 2 O 2 O 2从琼脂糖模具中扩散，将聚合物溶液交联15分钟（图6A）。 最后，丢弃顶部琼脂糖霉菌，而底部琼脂糖霉菌在孵育过程中用作多层结构的静止表面（图6A）。 如图6a所示，由于琼脂糖霉菌，在49天的孵育期内观察到良好的形状保持性，因为琼脂糖霉菌在其刚度较低的初始时间点支撑着多层耳的突出部分。 在最后一个时间点，使用手术刀在软骨和真皮的界面上做一个精确的切口，以评估软骨核心压缩模量的增加（图6B）。 在最后一个时间点，使用组织学分析评估了来自成熟耳朵结构不同部分的 3 个区域（图 6C）。 如图6D所示，得到的软骨质量最好，GAGS和II型胶原蛋白染色强烈，没有I型胶原蛋白染色。
综上所述，本研究采用了一种基于先进铸造策略的新型生物制造方法使用洗脱模具进行大型组织移植物。与传统的铸造方法相比，这种方法能够生物制造更复杂的结构，包括由不同材料和细胞类型组成的不同层。 由于没有严格的流变学要求，这种新的生物制造方法允许使用广泛的生物材料。 不同的材料和元素类型可以分层组合，与所选设计无关。 这项工作为这项技术提供了概念验证，使用两种不同的水凝胶和多种细胞类型来生物制造人类大小的称重传感器结构。 未来的工作将集中在铸造后每一层的更密集表征上，以及改善这种大型结构的培养条件，以减轻通过琼脂糖霉菌的扩散极限的影响。 这可以使用定制的塑料网格支架来实现，以保护结构，而不会引入物理屏障。
文章**：知之深，行之远。 基于全球制造专家网络，3D科学谷从全球视角为行业提供增材制造和智能制造的深入视角。 有关增材制造领域的更多分析，请关注3D科学谷发布的***系列。
*投稿 l 发送给2509957133@qqcom