荧光蛋白作为一种分子探针，它可以特异性标记靶蛋白、细胞结构和细胞器，在活细胞成像和超分辨率显微镜中起着至关重要的作用。 其亮度和光稳定性是衡量荧光蛋白在荧光显微镜中应用价值的核心指标。 自1992年成功克隆出第一种绿色荧光蛋白（GFP）以来，科学家们一直致力于改进荧光蛋白的这两个关键特性，以扩大其在成像技术中的应用。 最近，一个派生自 CUchidae 水母的绿色荧光蛋白被发现特别具有光稳定性，远远优于任何已知的荧光蛋白，并且被设计成与助记符一样明亮，因此得名staygold。然而，staygold本身是一种二聚体，限制了其作为荧光标记工具的应用范围。 2024年2月26日，西湖大学生命科学学院kiryl piatkevich该研究小组与莫斯科国立大学联合fedor subach研究小组在nature methods该杂志发表了一篇文章bright and stable monomeric fluorescent protein derived from staygold。他们选择利用定向进化的策略，成功开发了StayGold的单体版本，命名为MBAOJIN。这种荧光单体不仅继承了原始蛋白质的优良性能，而且具有更广泛的应用潜力。 通过分析MBAOJIN在不同pH条件下的晶体结构，并将其与StayGold和其他主流荧光蛋白进行比较，还揭示了单体化所必需的关键氨基酸突变，并进一步阐明了其优异光稳定性的分子机制。 MBAOJIN的高亮度和光稳定性，加上其优异的化学稳定性，使其成为研究细胞和亚细胞结构形态和动态变化的理想荧光蛋白工具，尤其是超分辨显微镜和扩增显微镜。 
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为了单聚化二聚体绿色荧光蛋白StayGold，作者通过将SatyGold的突变文库与ARAC蛋白的DNA结合域（aracDNA）融合，构建了图1A中的蛋白质表达载体。 当突变体为单体时，与ARAC融合的突变蛋白驱动报告基因mtagbfp的表达水平相对较低。 当突变体为二聚体时，与ARAC融合的突变蛋白驱动报告基因mtagbfp的表达水平相对较高。 在每一轮随机突变中，作者选择具有深蓝色荧光和最亮绿色荧光的菌落，并通过液相色谱法确认其寡聚状态。 经过八轮定向进化，最终确定了亮度最高的绿色荧光蛋白单体，并以mneongreen蛋白的N端和C端为接头肽，保证在哺乳动物细胞中的稳定表达，命名为mbaojin。 与StayGold的氨基酸序列一致，mbaojin具有以下突变：S55T、H77R、E80G、Q140P、H141Q、C165Y、N171Y和T201A。 为了检测mbaojin在哺乳动物细胞中是否是单体的，作者在hela细胞中表达了融合到内质网锚结构域（cyterm）的mbaojin，并计算了没有涡旋结构的健康细胞的比例。 使用串联和单体版本的 StayGold（TD8OxSTAYGOLD、StayGold-E138D 和 MstayGold，也称为 QC2-6 FIQ）作为比较，并使用经过验证的单体（MEGFP、MCLover3、MGreenLantern）和弱二聚体（EGFP、Venus）进行比较。 Mbaojin 有一个分数是 93 分7%，达到细胞中单体化的阈值。 这些结果证实了mbaojin是一种单体蛋白。 
单体化 staygoldmbaojin的晶体结构在文章中，作者解析了 mbaojin 的 ph 值。 6 和 8将5处的X射线晶体结构与STAYGOLD的二聚体结构进行比较，发现MBAOJIN的结构在不同pH值下差异无统计学意义，MBAOJIN的二聚体界面与亚基A和B之间的接触较少，荧光团附近的氯离子口袋在MBAOJIN的所有结构中都与STAYGOLD相似且相似。 为了进一步了解MBAOJIN增强光稳定性的分子基础，作者在与荧光团相互作用的位点（以PDB编号）进行了氨基酸的点突变。 结果表明，mbaojin N137K、mbaojin S134p和mbaojin V152e突变体的光漂白率为15-6.5 和 45次。 比较可光漂Mbaojin蛋白和较少光漂白的Mneongreen和EGFP蛋白的荧光团环境，发现可光漂白的Mbaojin蛋白在荧光团周围形成了更多的氢键和疏水键。 表征了mbaojin在细胞和纯化蛋白中的理化性质在验证了mbaojin是一种单体蛋白后，作者进一步表征了纯化的mbaojin蛋白的光谱和生化性质。 研究发现，与StayGold相比，mBaojin产生的单体化突变并未改变其吸收和荧光光谱特性。 但是，mbaojin的分子亮度比staygold低109 倍，但比 mneongreen 亮 1 倍24倍。 在低激发强度（约13 mW mm2，活细胞成像条件下），MBAOJIN的光稳定性分别比EGFP、mneongreen和mgreenlantern高15倍、9倍和130倍，尽管这种差异在高功率（约120 mW mm2）下不太显着。 Mbaojin 在 37 岁时迅速成熟，成熟时间为 75 分钟，比 StayGold、Mneongreen 和 EGFP 快 1 分钟8 次，22x 和 18倍，成熟最快的荧光蛋白之一。 此外，MBAOJIN的荧光表现出极高的化学稳定性，与其他单体GFP相比，pH值稳定高达437。在6 M GDNHCL中孵育24 h后，MBAOJIN的荧光增加了18%，而化学最稳定的荧光蛋白之一HFYFP的荧光仅增加了1%，StayGold的荧光降低了2%，MneonGreen的荧光完全猝灭。 在HEK和HELA细胞中，mBaojin与红色荧光蛋白（Fusionred或mcherry）通过P2A共表达，红色荧光使蛋白的表达水平归一化。 与EGFP相比，MBAOJIN在HEK和HeLa细胞中的细胞内亮度始终高出约70-140%，同时与（N1）StayGold（C4）和MstayGold相当。 此外，扩增显微镜预处理的HEK细胞中mbaojin的亮度分别是mneongreen、hfyfp和mstaygold的17倍4 次，38次。 在对HEK细胞进行的光漂白实验中，作者使用了35倍的照明功率（即50倍）5 mW mm2），以便可以在更短的时间内观察到光漂白速率的差异。除了 staygold 及其衍生的荧光蛋白外，还有 1朝九比二MBAOJIN的光稳定性是其3倍，其光漂白速度是现有GFPS的4倍6 至 85 次。 StayGold 的串联二聚体 TD8OX2STAYGOLD 在亮度和光稳定性方面优于所有经过测试的 GFP，在 HEK 电池中表现最佳。 mbaojin的活细胞成像和超分辨率显微镜Mbaojin与波形蛋白、人细胞色素c氧化酶亚基viii、h2b、角蛋白、微管蛋白、肌动蛋白等结构蛋白融合后成像。 作者使用超分辨共聚焦显微镜对mbaojin和mneogreen的融合蛋白进行长达60分钟的成像，mbaojin没有进行光漂白，而mneongreen在相同条件下将初始荧光值降低了25%。 然后使用稀疏去卷积结构照明显微镜对活细胞中的肌动蛋白纤维进行成像，在更高的光照功率（150-200 MW mm2）下，Mbaojin的光稳定性比MneonGreen高2.。5-4次。 **在蠕虫中，mbaojin 在神经元细胞内亮度较强的神经元中表现出比 mneongreen 慢 4 倍的光漂白速度，在光漂白 15 分钟后保留 50% 以上的初始荧光。 在活的小鼠脑组织中，mbaojin 比 mneongreen 更亮7 倍，但比 mstaygold 深 1 倍7次。 然而，在PFA固定的脑组织中，MstayGold和Mbaojin表现出相当的亮度和光稳定性，明显优于MneonGreen。 由于其高化学稳定性，MBAOJIN 用于线粒体、微丝微管和 HeLa 细胞小鼠脑组织的扩展显微镜成像。 重要地MBAOJIN还在扩展的脑组织中保持其高光稳定性，在减少光漂白的同时实现大体积超分辨率成像。 Kiryl D.，西湖大学研究员皮亚特克维奇和莫斯科国立大学费多尔五世Subach教授是《**》、《Hanbin Zhang》、《西湖大学博士生》和《Gleb D.》的共同通讯作者Lesnov博士是该论文的共同第一作者，西湖大学博士生Wenhao Zhang和研究助理St**rini Papadaki参与了部分研究。 **项目中使用的质粒可以通过西湖实验的质粒平台免费获得：。 此外，基丽尔 D2023年，Piatkevich在Nature Methods上发表了一篇关于近红外荧光蛋白系统表征的论文，相关质粒也可在Westlake实验的质粒平台上获得。 Wekwikgene是中国第一个质粒库，由Piatkevich教授发起，由西湖生命科学与生物医学实验室资助。 所有质粒都经过严格的质量控制和测试。 在**上，您可以找到每个质粒的完整序列，同时它提供了用户友好的体验，支持创建用户帐户和实验室页面，并提供了提高科学工作可见性的机会。 Wekwikgene保证快速、免费地交付高质量质粒，以支持和促进开放科学。 原文链接：
引用
1. a highly photostable and bright green fluorescent protein |nature biotechnology
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