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Expi293F 表达用于荧光内毒素检测的重组鲎试剂因子 C
作者：
柯文峰1,2,3， 李世杰1,2,3， 郑梦林1,2,3， 白忠虎1,2,3， 杨彦坤1,2,3
单位：
1 江南大学工业生物技术教育部重点实验室。
2 江南大学国家粮食发酵与食品生物制造工程技术研究中心。
3 江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心。
**项目：
国家重点研发计划（2018YFA0900804）; 国家轻工业技术与工程一类学科自主项目（lite2018-24）。
摘要>关键词
总结：马蹄蟹C因子是一种丝氨酸蛋白酶，对微量内毒素高度敏感，可作为LAL的替代品，用于制药行业的内毒素检测。 然而，其重组表达困难，需要高度控制环境中的内毒素。 本文从东方鲎中克隆了**的全长C因子，在N端和C端分别加入Flag标签和6个His标签，将原有的C因子信号肽替换为哺乳动物细胞表达载体中分泌的信号肽。 将重组质粒转染人胚胎肾细胞Expi293F悬浮培养物7 d，收获上清液，Western blot检测出的蛋白符合**大小128 kDa，具有与内毒素结合的能力，结合后可裂解荧光底物。 本研究首次在人胚胎肾细胞Expi293F中成功表达具有生物活性的全长因子C，表达水平达到1918 mg L，比昆虫细胞SF9中DING的表达量高113%。 该方法对后续低成本内毒素检测试剂盒的开发具有指导意义。
关键字：内毒素检测; 马蹄蟹C因子; expi293f；重组表达; 脂质转染。
主要结论：
为构建有效的重组因子C（RFC）表达体系，本研究克隆了三齿速蚤中因子C的全基因序列，并首次在人胚胎肾细胞Expi293F中进行重组表达。 经检测，RFC可溶于细胞外分泌，大小与**一致，初始纯度为48%，镍柱纯化后的RFC纯度达到98%，收率为56%，与SF9细胞相比，蛋白表达（1981 mg l）增加了113%，大大降低了表达成本。它具有与内毒素结合并裂解荧光底物的生物活性。 该表达系统将为重组检测的开发提供新的途径，并有助于内毒素检测。
a-pcdna3.4-RFC质粒双消化琼脂糖凝胶电泳分析; b-pcdna3.4-RFC矢量图。
图1 RFC基因的克隆及载体构建。
fig.1 cloning and vector construction of rfc
细胞培养上清液的A-Western印迹测定（Flag标签）; B细胞培养上清液的蛋白质印迹法（His标签）
图2 Expi293F细胞中RFCs的蛋白质印迹检测。
fig.2 western blot detection of rfc expression in expi293f cells
注：M：蛋白质标准分子量标记物; 1：非还原上样缓冲液处理的细胞培养上清液; 2：用还原上样缓冲液处理的细胞培养上清液; 3：非还原上样缓冲液处理的细胞培养上清液; 4：用还原上样缓冲液处理的细胞培养上清液。
A细胞培养上清液的SDS-PAGE测定; 纯化后的B-SDS-PAGE检测。
图3 RFCs的表达和纯化。
fig.3 expression and purification of rfc
注：M：蛋白质标准分子量标记物; 1：非还原上样缓冲液处理的细胞培养上清液; 2：纯化RFC的非还原上样缓冲液处理
图4 RFC结合内毒素裂解荧光底物。
fig.4 rfc combined with endotoxin to cut fluorescent substrate
注：* 表示显著差异 （p < 0.）。05）。
在此之前，本团队还重组表达了东方马蹄蟹的C因子**在大肠杆菌BL21（DE3）、毕赤酵母GS115和谷氨酸棒状杆菌BZH001中，但遗憾的是，LAL的C因子在大肠杆菌、毕赤酵母和谷氨酸棒状杆菌中没有表达，推测鲎剂C因子是一种具有双链结构和多个糖基化位点的大分子蛋白， 所以它不能在原核生物和低等真核生物中表达。本研究首次在人胚胎肾细胞EXPI293F中成功重组表达RFCs，与蛋白质结构模型一致，具有与内毒素结合和裂解荧光底物的生物活性，其裂解荧光底物的能力高于LOZA试剂盒中的RFC。 与昆虫细胞SF9中DING的表达水平（9 mg L）相比，该表达系统的蛋白表达（1981 mg L）增加了113%。该方法对后续低成本RFC重组表达系统和内毒素检测试剂盒的开发具有重要的指导意义。
认识团队。 
近年来，江南大学白忠虎教授团队专注于合成生物学、生物医药和生物反应器领域的研究，并取得了丰硕的成果，相关研究成果发表在Nature Catalysis（2023）、Biotechnology and Bioengineering（2023）、ACS Synthetic Biology等该领域权威期刊上。
通讯作者
杨彦坤副教授是江苏省“六大人才峰”候选人。 从事发酵工程、微生物学、分子生物学和合成生物学的研究，主要负责分子生物学、生物化学和高级分子生物学课程的教学。 发表SCI研究论文60余篇，参与编纂专著3部; 申请发明专利20余项;主持国家重点研发计划、863、国家自然科学**等国家级、省部级科研项目8项; 主持企业横向项目7个; 获商联国家科技进步二等奖1项; 他指导学生获得了3个国家和省级竞赛奖项。
引文格式
柯文峰， 李世杰， 郑梦林， 等. Expi293F重组马蹄蟹因子C在荧光内毒素检测中的表达[J].食品与发酵工业， 2024， 50（2）：106-111