许多生物分子只在水溶液中具有活性,脱水后,不仅其生物活性变化很大,而且其结构也发生了一定的变化。 因此,溶剂水在活性生物分子的研究中是不可替代的。 水是一种强极性分子,在3400和1640 cm-1区域存在宽而强的红外吸收带,水的吸收带经常与目标生物分子的吸收带重叠或部分重叠,这使得生物分子的红外光谱复杂且难度高。 在早期的红外教科书中,经常有人说“红外光谱不适合水溶液或水性物质的分析”,说明了水峰干扰的严重性。 在许多实践中,为了获得目标物质的高质量红外光谱,必须减去水的红外吸收峰(干扰峰)。
去除吸水带的一种方法是用氘代水(D2O)代替水(H2O)作为溶剂。 由于同位素效应,D2O和H2O的IR波段位置存在显着差异。 然而,活性氢(—Cooh、—NH2 等)存在于许多生物分子中,并且 D2O 中活性氢 (H) 和氘 (D) 之间可以发生交换反应。 一般来说,为确保交换反应完成,D2O溶液必须放置足够长的时间或经历多次溶解过程。 氢氘交换可引起一些红外吸收带移动,甚至引起生物分子的局部构象变化。 更严重的是,研究蛋白质在水溶液(H2O)中的结构及其生理活性也没有什么实际意义,因为D2O中蛋白质的结构可能与H2O中的结构不同。
除了使用D2O溶剂外,光谱减法还广泛用于减去水峰的干扰。 在该技术中,减去溶液的红外吸光度光谱AS与溶剂水(或水参比溶液)的吸光度光谱AW之间的光谱差,以获得减去吸水峰干扰的光谱。 尽管该研究已经开展多年,已成为获得水溶液红外光谱的主要手段,但在光谱的重现性和偏差的不确定性方面仍有改进的余地。
在测量红外光谱时,通常分别得到被测样品的单光束光谱(样品单光束光谱)和参考样品的单光谱光谱(背景单光束光谱),两者的比值即为被测样品的透射光谱。 根据Lambert-Beale定律,如果水在背景光谱和样品光谱中完全相同,则水的吸收峰不会出现在最终的红外光谱上。 然而,很难控制参比样品和待测样品中水量的一致性。 衰减全反射 (ATR) 附件是目前获取水溶液红外光谱的常规方法。 然而,到目前为止,几乎不可能就参考样品和使用 ATR 测量技术测量的样品中有效水分子的总数达成共识。
为了测量红外光谱,首先测量溶液(K2CO3溶液或BSA溶液)的样品单光束光谱,然后测量参考样品的背景单光束光谱。 与传统的测量方法不同,双背景样本用于收集背景光谱。 首先,将空的ATR晶体扫描n次(n应足够大),暂停,用对照品溶液(15%NaCl溶液或纯水)填充ATR晶体,继续扫描,观察红外光谱图,可以看到水的吸收峰由强到弱消失的全过程,当获得无水吸收峰干扰的红外光谱时停止扫描。 实验路线框图如图1所示。
纯水的红外光谱可能与溶液中的水有些不同,包括条带的位置、吸收峰的形状等。 因此,在制备参比样品时,要求参比样品中水的状态尽可能与待测样品中的水的状态一致。 纯水和10%BSA溶液中的水的红外光谱基本相同,因此在这种情况下使用纯水作为参考样品。 但10%碳酸钾溶液中水的红外光谱与纯水不同。 据报告,碳酸钾氯化钠混合盐溶液中水的红外光谱与氯化钠盐溶液中的水非常相似,因此,在10%碳酸钾溶液的情况下,选择15%氯化钠溶液作为参考样品。
当使用单个ATR附件测量时,如果使用空的锗晶体作为参考样品,并使用10%碳酸钾溶液作为待测样品,则1640 cm-1处水的吸收峰强度约为0075(吸光度)。 若以15%氯化钠溶液为对照品,同时以10%碳酸钾溶液为供试品溶液,则在1640 cm-1处出现负而小的吸水峰。 这是因为与15%氯化钠溶液相比,10%的碳酸钾溶液含有更少的水。 吸收峰小的原因是两种溶液的含水量虽然有差异,但很小。
使用不同的参比样品(空锗晶体或氯化钠溶液),水(碳酸钾溶液)的吸收峰为正负。 那么,在测量背景光谱时,先用一个空白的锗晶体作为参考样品,多次扫描,暂停,然后将15%的氯化钠溶液填充在锗晶体上,然后继续扫描,随着扫描次数的增加,会发生什么?
实验结果如图2所示。 1643 cm-1是水的吸收峰,1400 cm-1是碳酸盐(CO23+)的吸收峰。 在实验中,首先测量待测样品的10%K2CO3水溶液的样品单光束光谱,然后根据上述描述以空白锗晶体为参考样品,对背景光谱(空白锗晶体)进行20次扫描,然后暂停。 得到图2a,其中水的吸收峰(1643 cm-1)为正。 在 1,2 ,...碳酸盐和水的吸收峰强度在20次扫描积累中保持不变。 暂停后,用15%氯化钠水溶液代替对照样品,再次扫描背景光谱。 随着新扫描的增加,碳酸盐的吸收强度继续保持不变(因为15%氯化钠溶液不含碳酸盐)。 然而,随着每次额外的扫描,吸水率略有下降(15%氯化钠大于10%碳酸钾)。 当氯化钠溶液扫描48次时,1643 cm-1处的水峰明显变小,如图2b所示。 每次对氯化钠水溶液进行额外扫描,吸水率峰值都会变小。 当扫描次数达到300次时,水的吸收峰已经完全消失,此时停止扫描会产生令人满意的红外光谱,不受吸收峰的干扰,见图2c。 该实验没有使用差分光谱进行操作。 因此,在实际测量时,纵坐标可以采用吸光度、反射率或透射率等单位。
图2c显示了使用ATR技术直接采集红外光谱,而不会产生水干扰峰。 需要强调的是,两个参考样品的扫描顺序对所获得的红外光谱的质量有重要影响。 空白锗晶体(水0)和10%碳酸钾溶液的含水量相差很大,而15%氯化钠溶液和10%碳酸钾溶液的含水量很小。 因此,将空白的锗晶体作为第一参考样品进行扫描,使水的IR峰显示出较大的吸收峰,如图2a所示。 不难理解,在第二阶段,强吸水峰逐渐减小,以达到预期的扣减效果。 如果15%氯化钠溶液是第一个参考样品,则吸水率峰(负)很小,但不可忽略。 在第二阶段,弱吸收峰(短时间)消失的过程不利于观察。 第一参考样品(空白锗晶体)的扫描次数(n)不宜太小,扫描次数n越大,演绎效果越好,也要求积累时间越多。 为了获得令人满意的信噪比,第一参考样品的扫描次数应控制在20至32倍之间。 必须根据所扣除水峰的强度变化实时选择第二个参考样品的实际扫描次数 m。 其原理是水扰动峰值信号可以忽略不计,并停止扫描。
为了评估新方法对减去水峰的影响,我们将结果与传统的差分光谱技术进行了比较。 以空白锗晶体为参考样品,测得10%碳酸钾和15%氯化钠的红外光谱。 选择合适的减法系数,减去两种解的红外光谱,得到图3a。
从图3的比较可以看出,新的双参考采样方法(图3b)效果更好,信噪比明显提高,特别是在1640 cm-1范围内。 双参考样品的另一个优点是易于操作,并可根据需要进行实时监测。 在单ATR附件中,双参照样品法成功减去水干扰,效果良好。
双参考样品(空白锗晶体+水),背景光谱包含有关水和空气的信息。 所需的背景光谱是关于水层适当厚度的信息。 双参比法只有在双参比样品的单光束光谱与水的单光束光谱高度相似的情况下才能取得良好的效果。 下文将讨论这种方法的局限性。
图4显示了使用双样品方法获得的红外光谱。 参考样品都是空气,要测试的样品是聚苯乙烯(PS)(图4a)或双(聚苯乙烯+空气)。 图4a显示了PS薄膜的红外光谱,图4b,c,d和e显示了双样品(聚苯乙烯+空气)的红外光谱。 与图4a相比,图4b、c、d和e中的光谱均明显失真。 即,图4b、c、d和e中的光谱不能代表PS的红外光谱。 在什么条件下,空气和聚苯乙烯样品的红外光谱可以与纯聚苯乙烯的红外光谱高度相似?
放大图4中的2000 1640cm-1区域,得到图5。 将图5b、c、d、e中的峰与a中相应的峰进行比较,强度不同,但峰形畸变不明显。 在2000 1640cm-1区域没有很强的吸收峰,对红外光的吸收很小。 因此,红外峰的吸光度是影响畸变的重要因素。 吸收峰越弱,即吸光度a越小,畸变程度越小。 吸收越强,如图4所示,带有星号吸收带,畸变越严重。
可以想象,影响失真的另一个因素是双样本中最终光谱中真实物质(PS)信号的比例。 M 扫描 PS,n 扫描空气,总共 (n+m) 次扫描。 当 n 等于零时,它等于 ps 的频谱,没有失真。 当M等于零时,得到空气的光谱,以PS光谱作为判断标准,畸变最为严重。 失真可以用m(n+m)来判断,当该值等于最大值1时,不失真。 m (n+m) 的值越大(接近 1),从累积频谱中获得的失真就越小。
图 6 显示了水的 ATR 光谱,即水和空气的混合 ATR 光谱。 图6中所有参比样品均为空白GE晶体,即锗晶体表面未添加样品,背景光谱扫描32次。 图6a显示了水的ATR光谱,采集了64个水样。 从图6a可以看出,在3400 cm-1处水的最强峰处,在单次ATR辅助测量中,吸光度约为03.在1640cm-1处的吸光度约为0075。在图6b中,C和D,通过多次扫描水样和多次扫描空ATR晶体来收集样品,因此图6b,C和D中的ATR光谱是混合双样品(水+空气)光谱。
混合光谱6b和6a(纯水ATR光谱)的峰模式高度相似,如它们之间的差异所示(图6F)。 m (n+m) = 48 (16+48) = 0.图6b中75,即对于单个ATR附件测量,只要m(n+m)大于0如图75所示,所得的混合光谱没有明显失真,并且可用于获得高质量的红外光谱测量,并消除了水的干扰。 混合光谱 6d, m (n+m) = 025 与水光谱6a相比,存在明显的畸变,因此图6a和图6d之间的差异远非理想的直线,见图6h。 在实践中,只要参比溶液(如15%NaCl溶液)的含水量略高于单个ATR附着的待测溶液(10%碳酸钾溶液)的含水量,计算表明,这种新方法可以获得无水峰干扰的高质量红外光谱。