双荧光素酶实验原理它是利用荧光素酶与底物结合化学发光反应的特性，克隆萤火虫荧光素酶基因上游基因转录的调控元件，构建荧光素酶报告质粒。 然后转染细胞，在适当的刺激或处理后裂解细胞，并测量荧光素酶活性。 可以确定不同刺激在刺激前后对感兴趣的调节元件的影响或荧光素酶活性水平的影响。 同时，为了减少内在变量因素对实验准确性的影响，采用含有rinilla荧光素酶基因的质粒作为对照质粒，将细胞与报告质粒共转染，为转录活力提供内控，使试验结果不受实验条件变化的干扰。
发光原理。 双荧光素酶实验的具体步骤。
1.报告质粒的构建。 将目标片段插入表达荧光素酶的报告载体中，例如PGL3-BASIC。
2.转染细胞。 细胞与报告质粒和 PHRL-TK（内部对照）共转染，并根据需要进行处理。 共转染时，由于内部对照的强启动子，报告质粒：参比转染量通常为 10：1 至 50：1。
荧光素酶活性测定：初次使用时，准备LAR II，萤火虫荧光素酶的底物。 将LAR II溶解在LAR II缓冲液中，并等分-80，避光储存。 加入 1x PLB 并在室温下裂解细胞 15 分钟。 配制 STOP&GLO，一种肾荧光素酶的底物，能够终止 LAR II 反应。 荧光值的测定。 将 10 μL 细胞裂解物加入 40 μL LAR II 中，移液并混合，并测试读数，即萤火虫荧光素酶的值。 加入 40 ul STOP&GL 并再次读取，这是 Renilla 荧光素酶的值。 数据处理。 首先计算每管中萤火虫荧光素酶肾荧光素酶的比例，然后以对照组的比例为1，得到不同治疗组的相对荧光素酶活性，即治疗组基因转录的调控活性。 结果解释
文学 I：pmid: 28697764；if=41.444
（1）方法
（2） 结果
验证 LINC00673 和 MIR-150-5P 的绑定。 野生型LINC00673与mir-150-5p结合，但突变型LINC00673不能。 通过构建荧光素酶报告载体将荧光素酶与Linc00673基因连接，然后转染到细胞中以检测荧光活性。 结果表明：mirpMIMICS显著减少野生型linc00673荧光素酶活性，但用于突变形式linc00673荧光素酶活性无效。以上结果表明：linc00673提供 mirP-组合
文学 II：pmid: 35963157；if=5.741
（1）方法
（2） 结果
验证了YAF2和MIR-217-5P的结合。 野生型 YAF2 与 Mir-217-5P 结合，但突变型 YAF2 不能。 通过构建荧光素酶报告载体将荧光素酶与 YAF2 基因连接，然后转染到细胞中进行检测。 结果表明：mirpMIMICS显著降低了野生型YAF2的荧光素酶活性，但对突变型YAF2的荧光素酶活性没有影响。以上结果表明：YAF2 可与 MIR 一起使用P-组合
文献 III：pmid: 35212607；if=6.832
（1）方法
（2） 结果
本研究验证了 PEG10 和 Mir-449A 以及 RPS2 与 Mir-449A 的结合。 这里我们以 PEG10 和 Mir-449A 为例。 野生型 PEG10 与 Mir-449A 结合，但突变型 PEG10 不能。 荧光素酶通过构建荧光素酶报告载体与 PEG10 基因连接，然后转染到细胞中进行检测。 结果表明：mir-449aMIMICS显著减少野生型peg10荧光素酶活性，但用于突变形式peg10荧光素酶活性无效。证明peg10跟mir-449a靶向结合
文献 IV：pmid: 35110549；if=9.685
（1）方法
（2） 结果
验证 PAARH 和 HOTTIP 分别与 6 个 miRNA 的结合。 上述结果表明，miRNA转染组的荧光活性显著降低，表明miRNA与Paarh和Hottip之间存在靶向结合。
请注意，本研究中没有突变结果，这样的例子也很少一般来说，荧光素酶的结果需要包括突变型和野生型，所以在设计自己的实验时要注意这一点
荧光