细胞**的配方和制造工艺的效率和功效都受到冷冻的影响，因此有必要了解冷冻保存对细胞的影响，以便细胞**的成功商业化生产。 在这项研究中，研究人员研究了某些工艺参数 （CPP） 对人 PAN CD3+ T 细胞解冻后存活率、激活后扩增和细胞因子分泌的影响，以评估这些参数在冷冻保存过程中的重要性。
本研究的CPPS参数包括冻存溶液配方、DMSO含量、解冻后（预稀释洗涤）稳定性和活化时间线，并通过膜完整性、增殖率和活化后INFY分泌来评估活性，以表征细胞和冻存过程。
·细胞培养
通过解冻人PAN CD3 + T细胞将细胞接种在6孔板中，解冻后1小时，用抗CD3 CD28 CD2 T细胞激活剂激活细胞，并将细胞培养板置于37°C和5%CO 2的培养箱中10天，并将细胞从培养箱中取出以收集细胞用于制剂和冷冻保存。
·低温保存溶液选择
四种不同的冷冻保存解决方案，Cryostor CS5、Cryostor CS10 和 2 种常见的实验室自制冷冻保存解决方案。 用于冷冻保存的 T 细胞。 两种自制配方含有 Normosol-R 或 Plasmalyte （PLA） 和相同的成分，即 5% W V 重组人血清白蛋白和 10% V DMSO（BloodStor 100，BioLife Solutions）。
·冷冻保存
从培养箱中取出含有细胞的培养基，并收集在15ml离心管中。 冷冻前取出每组样品以评估计数和活力。 将T细胞沉淀球化并重悬于冷冻保存溶液中。 以 1 ml 体积分布在 2 ml 冷冻管中，并将细胞在 2-8C 下孵育 15 分钟。 然后将小瓶移至程序化的冷却器中，以-1°C分钟冷却，并在10°C下手动成核。 达到-70°C后，将小瓶转移到LN 2中储存至少24小时。
·除霜和评估
将样品在37°C水浴中解冻，然后以1：10的比例重悬于预热的XF T细胞培养基中。 解冻后立即收集样品进行活力和计数测量。 将每个细胞组接种在常规6孔板的2个孔中，一个孔用于静息对照，一个孔用于评估活化。 解冻后，加入抗CD3 CD28 CD2激活试剂进行活化。 此时，将 6 孔板转移到含有 37% 和 5% CO 2 的培养箱中，用于以下一系列研究
1-为了研究活化前静息的效果，将一组T细胞样品冷冻保存在Cryostor CS5中，并在解冻后培养物中静置24小时后活化。
2- 为了研究DMSO浓度的影响，比较了在CryoStor CS5和CryoStor CS10中冷冻保存的两组T细胞样品，分别具有5%和10%的v DMSO。
3-为了研究解冻后细胞处理前细胞静息期的必要性，在进一步处理之前，将一组样品在解冻后立即在室温下放置1小时。
对于所有样品，在解冻后 24 小时和 72 小时，从每个孔中取出一小块以评估活力、计数 （Chemometec NC-3000） 并检测 Infy 分泌 （ELISA）。
1、即食型市售CS10及自制配方冻存液的影响研究
在DMSO含量相近的10% V V的3组不同组中，CS10组的活力恢复速度快于其他2组自制冻存溶液，与未冷冻的T细胞对照组接近。
T细胞活化后，各组T细胞活力均下降，解冻后72 hCS10组细胞活力与解冻对照组最接近，且在统计学上也高于其他2个自制冻存组。
总体而言，对使用 10% DMSO 的 3 组冷冻保存溶液进行比较，发现解冻和活化存活率之间的活力差异不大。 然而，在解冻后72 h，三组间扩增和INFY分泌差异有统计学意义。 在 CryoStor CS10 中冷冻保存的细胞数量在 72 h 内增加到与解冻对照相同的水平，高于其他两组在 Normosol HSA 和 PLA HSA 冷冻保存溶液中冷冻保存的细胞数量。 INFY比较也是如此：CS10组的分泌水平明显高于其他组，仅略低于未冷冻的对照组。
2. DMSO浓度影响的研究
通过比较Cryostor CS5和CS10制剂（分别为5%和10% V DMSO）的影响，研究了在冷冻保存溶液配方中增加DMSO浓度对细胞冻存的影响。
从图2可以看出，CS10组解冻后72 h的活力低于活化的CS5组，但CS10组的细胞扩增率显著高于CS5组，INFY的分泌也显著高于CS5组。 此外，必须提到的是，在细胞活力和扩增潜力方面，较低DMSO浓度下冷冻保存细胞的性能（5%V v下的Cryostor CS5）与实验室制造的10% V DMSO冷冻保存的性能相当。 与含有 10% v DMSO 的自制 PLA 制剂相比，CS5 冷冻保存的细胞分泌更多的 INFY。
3. 解冻后细胞处理前细胞静置期必要性研究
T细胞解冻后3种不同激活方案的比较：
1）解冻后立即处理并激活。
2）解冻后等待（1小时）进行进一步处理。
3）处理后24小时活化并孵育。
从图中可以看出，活化导致细胞解冻后短时间内失去活力。 因此，据推测，确保在激活前解冻后（在这种情况下为 24 小时）有一个细胞静息期可能有助于减少细胞损失和提高扩增率。
然而，解冻后的稳定性是细胞制造和实践中的一个风险问题，建议在洗涤或患者给药之前提前了解解冻后细胞保持稳定多长时间。 本研究的结果表明，与解冻后立即处理的样品相比，在室温（20-25°C）下解冻后等待1小时对细胞扩增能力和INFY分泌的影响更大，有趣的是，细胞活力在1小时等待组中保持统计学上没有变化，因此仅存活率不足以评估这些工艺参数对T细胞质量的影响。 此外，观察到解冻后和活化前在培养基中孵育 24 小时并不一定能减少活化后细胞活力的损失（图 2）。
与传统的实验室制备冻保存溶液相比，CryoStor 是一种更可靠的人 CD3+ T 细胞冻存配方，即人 CD3+ T 细胞冻存液中冷冻保存的其他人 CD3+ T 细胞与其他两种测试配方相比，Normosol-R + 5% W V RhSA + 10% V V DMSO 和 Plasmalyte-A + 5% W V Rhsa + 10% V V DMSO， 解冻后显示出增强或至少同等的质量和功能。
此外，在较低DMSO浓度（5%VV）下冷冻保存的细胞的性能与使用10%VV DMSO的实验室制造的冷冻保存溶液相当，这表明使用冷冻保存溶液（如冷冻器配方）是降低产品中DMSO含量的潜在方法。
与 Cryostor 的两种冷冻保存产品相比，较高浓度的 DMSO （10% Vv） 似乎比较低浓度的 DMSO （5% Vv） 更有效地保存人类 T 细胞。
在解冻后相同的时间，静息培养物的扩增率和INFY分泌量明显低于即刻细胞活化组，这表明解冻后立即活化T细胞可能更有益，以优化制造时间。
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