一般可分为三个阶段:荧光背景信号阶段、荧光信号指数放大阶段和平台期,其形状为平滑的S形曲线。
如果荧光背景信号阶段有很多拐点,可能的原因可能是体系不均匀或有固体杂质; 如果向下探头后抬头再快速低头,可能是因为系统中的模板量太高,建议在使用前稀释模板。 如果存在引物二聚体,阴性对照将向上查找,这在实时荧光定量PCR中很难避免; 如果阴性对照的溶出曲线显示与样品中的峰相同,则系统配置中存在污染,无法获得实验结果。
溶出曲线中的电流双峰有三种可能性:
1.引物峰,引物峰通常是两个峰中的第一个峰,消除它的方法是减少体系中的引物用量或重新设计引物;
2.在做基因表达差异时,容易出现DNA扩增峰(仅当引物与内含子交叉时才存在),其原因是RNA提取时存在DNA污染,可以通过电泳进行验证,RNA样品中的DNA应重新消化;
3.扩增是非特异性的,因此应重新探索扩增条件或重新设计和验证引物。
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