后生元功能及应用研究进展
总结：后生元是指为宿主带来健康益处的无生命微生物或其成分的制剂，是微生态制剂领域的一个新兴概念。 后生元具有平衡肠道菌群、增强肠上皮屏障功能、增强免疫调节、促进新陈代谢等多种作用，具有稳定性高、安全性高、易储存等优点，使其在食品、保健品、化妆品、饲料等领域具有广阔的应用前景。 目前，后生元的研究、开发和应用仍处于起步阶段，在明确有效成分和用量、明确作用机理和靶点、制定相应法规和标准等方面仍需更深入的探索。 本文阐述了后生元的功能特点、制备方法、鉴定方法及市场应用，为后生元的研究、开发和应用提供参考。
关键字：后生元; 益生菌; 益生菌功能; 作用机制; 工业应用。
联合国粮食及农业组织和世界卫生组织的提议益生菌; 定义：摄入足够量的活微生物对宿主的健康有益。在过去的几十年里，益生菌在改善人类健康以及动植物生长和健康方面的作用已被众多研究证实。 随着研究的深入，越来越多的研究发现，益生菌的死菌及其代谢产物还具有多种功能活性，可以刺激组织发育，影响机体的营养水平和生理功能。 Tsilingiri等人首次将这种无生命的死细菌及其成分称为“后生元”。 2021年，国际益生菌和益生元科学协会发布了一份关于全球后生元的共识声明，将：后生元; 定义为具有明确遗传背景的灭活微生物和/或细菌成分，无论是否具有代谢物
后生元具有多种功能特性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、平衡肠道菌群、增强肠上皮屏障功能、增强免疫调节和促进新陈代谢。 除了上述功能外，后生元与益生菌相比还有几个优点：一是它们更稳定，保质期更长，环境耐受性更好; 其次，它更安全，更适合一些特殊人群，如新生儿和敏感人群。 后生元也不受抗生素干扰的抑制，不存在传递抗性基因的风险; 第三，它的目标范围更广; 第四，后生元中的活性物质更容易被肠道吸收，提高利用率; 第五，后生元的靶点范围更广，不仅限于肠道，还包括口腔、泌尿生殖道或鼻咽部。 因此，后生元应用范围广泛，可应用于食品、保健品、化妆品、饲料、植物营养等多个行业，具有广阔的市场应用前景。
后生元功能概述
后生元主要分为两部分：细菌成分和细菌代谢产物。 其中，细菌成分主要包括肽聚糖、磷壁酸、甘草酸、缩醛磷脂、膜蛋白和细胞内多糖。 细菌代谢产物包括维生素、脂类、有机酸、细菌素、酶、胞外多糖、短链脂肪酸等，其复合物组成也决定了其功能的多样性，大量的体内实验和体外实验（表1）证实了后生元功能的多样性。
表1后生元的体外和体外实验
table 1 in vivo and in vitro experiments of postbiotics
1.1.平衡肠道菌群
肠道菌群与宿主健康之间存在交互关系，后生元可以通过改善肠道菌群来促进宿主健康。 在一项随机、双盲平行临床试验中，口服巴氏杀菌乳杆菌CP2305与安慰剂组相比，显著改善了实验组成员的焦虑和睡眠障碍，粪便菌群分析发现，实验组肠道双歧杆菌含量显著增加，但作用的具体机制尚不清楚，需要进一步研究。 Kimoto-Nira等[13]发现，口服热灭活乳球菌G50可刺激免疫球蛋白A的分泌，增强肠道免疫力，抑制有害细菌的增殖。 在一项对后生元**2型糖尿病大鼠模型的研究中，热灭活的嗜热链球菌不仅降低了空腹血糖水平，降低了葡萄糖耐量和胰岛素抵抗，还有效地增加了瘤胃球菌和Velon cocci等有益菌的丰度。 Izuddin等报道了后生元对断奶羔羊的益生菌作用，结果表明，服用植物乳杆菌RG14游离上清液可增加琥珀酸杆菌和黄原菌的数量，减少产甲烷菌的数量，提高宿主的养分摄入和养分消化率，减轻断奶应激对羔羊生长的不利影响。 此外，一项体外实验表明，乳酸菌和双歧杆菌16株菌株的无菌上清液可以减少肠侵袭性大肠杆菌对T84和CaCO2细胞的侵袭，结果表明，这些无细胞上清液可以阻止EIEC侵入肠道细胞，但作用机制仍有待进一步探索。 肠道菌群与宿主之间存在多种信号传导系统，后生元可以改善肠道菌群的结构，预防和辅助各种疾病，如慢性肝病、结核病等。 鉴于后生元的安全特性，它们平衡肠道微生物群的功能有望用于帮助新生儿建立健全和有益的肠道微生物群。 1.2.增强肠上皮屏障功能
肠上皮细胞是肠道的第一道防线，不仅作为物理屏障，还与宿主免疫系统相互作用，限制有害物质和微生物向身体其他部位的迁移。 后生元中的各种成分可以修复或增强肠上皮屏障功能。 Gao等发现鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus Rhamnosus GG，LGG）发酵上清液可促进幼小鼠肠道屏障的形成，从发酵上清液中纯化出分泌蛋白HM0539，证明其对肠道屏障有较强的保护作用，表现为促进肠粘液蛋白的表达，防止脂多糖或肿瘤坏死因子诱导肠道屏障损伤。这表明这种发酵的上清液可能有助于新生儿肠道屏障的形成。可溶性蛋白P40也是鼠李糖乳杆菌GG的代谢产物，功能分析表明，P40能抑制肠上皮细胞凋亡，促进肠上皮细胞粘蛋白的产生，通过上调肠上皮细胞中增殖诱导配体的表达来促进IgA的产生，从而改善肠损伤和结肠炎。 p40的信号转导机制主要是激活解整合素-金属蛋白酶17并释放肝素结合的表皮生长因子，进而激活肠上皮细胞中的表皮生长因子受体，从而刺激多种下游信号通路，如原活化蛋白激酶信号通路，进而诱导细胞增殖、分化、 迁徙和生存。上野等发现，热灭活短乳杆菌SBC8803可提高葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠的存活率，进一步研究发现，SBC8803热灭活短乳杆菌通过诱导热休克蛋白、激活丝裂原活化蛋白激酶P38（P38 MAPK）通路、调节肿瘤坏死因子白细胞介素-1和白细胞介素-12的表达，增强肠道屏障功能， 从而改善结肠炎小鼠模型的肠道损伤。后生元具有与活益生菌相似的益生菌作用，并且更安全，并且在不适合活益生菌的条件下，后生元是预防和发展炎症性肠病的有效且潜在的选择。
1.3 增强免疫调节
后生元还可以通过增强身体的免疫调节功能，尤其是肠道免疫力来改善身体的健康。 肠道是人体最大的免疫器官，约占人体免疫系统的70%，后生元通过肠道调节宿主免疫系统，从而提高人体的免疫力。 Martorell等人发现，失活的长双歧杆菌保留了抵抗氧化应激损伤的能力，同时它还通过激活与先天免疫功能相关的途径来减少急性炎症反应和肠道屏障破坏，并抑制有害细菌的定植。 通过体外实验，研究人员证明，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌的上清液可以减少TNF-的分泌，增加抗炎因子白细胞介素-10的分泌，从而达到抗炎作用。 De Marco等发现，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、罗伊氏乳杆菌和布氏酵母等游离上清液可下调结肠上皮HT-29细胞中前列腺素E2和IL-8的表达，并调节巨噬细胞IL-1、白细胞介素-6、TNF-和IL-10的表达，具有独特的抗炎活性。 还发现，热灭活的加氏乳杆菌TMC0356比活的加氏乳杆菌TMC0356具有更好的免疫调节功能，这表现为热灭活的加氏乳杆菌TMC0356可以诱导巨噬细胞产生更多的IL-12，对N-乙酰壁酰胺酶具有更强的抗性。 在离体器官模型实验中，干酪乳杆菌DG发酵上清液能够降低腹泻性肠易激综合征患者回肠和结肠粘膜中白细胞介素-1、IL-6和白细胞介素-8的水平，并增加IL-10 mRNA的水平，从而降低回肠和结肠粘膜的炎症反应。 在小鼠模型中的一项实验发现，热灭活的植物乳杆菌B240可以通过刺激IgA分泌来有效保护宿主免受鼠伤寒沙门氏菌的侵害。 同样，热灭活的副干酪乳杆菌MCC1849可诱导肠道组织中Ig+细胞分泌免疫球蛋白（IgA），影响肠道集合淋巴结中滤泡辅助性T细胞的产生，从而刺激宿主的获得性免疫反应。 研究表明，后生元免疫调节的功能特性有助于 COVID-19 患者的佐剂和阳极。
1.4.促进新陈代谢
后生元调节人体新陈代谢的方式包括直接调节活性物质进入人体循环系统，以及通过调节肠道菌群进行间接调节。 临床实验表明，后生元对多种代谢性疾病有辅助作用。 Lee等发现，定期口服植物乳杆菌L-14裂解物可在脂肪细胞分化初期刺激腺苷酸活化蛋白激酶信号通路，抑制脂肪前体细胞3T3-L1和人骨髓间充质干细胞分化为成熟脂肪细胞，控制小鼠体重增加和脂质分布。肥胖和代谢紊乱。Montazeri-Najafabady等研究了5种益生菌（嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、长双歧杆菌和凝结芽孢杆菌）的细胞裂解物和上清液对卵巢切除大鼠的影响，结果表明，多种后生元显著提高了宿主全身骨矿物质密度，其中干酪乳杆菌上清液显著提高了脊柱的BMD， 干酪乳杆菌和凝结芽孢杆菌的裂解物和上清液，长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的裂解物显著增强股骨BMD;虽然后生元不能显著提高血清钙浓度，但可以提高宿主的钙吸收率，因此具有用于改善女性绝经后骨质疏松症的潜力。 此外，ADR-159（热灭活发酵乳杆菌和德氏乳杆菌共培养发酵液）显着降低雄性小鼠的皮质酮水平并改变神经代谢物水平，从而缓解抑郁症状。 Humam等发现，植物乳杆菌RI11的游离上清液可以提高抗氧化酶的活性，上调IL-10的mRNA表达，下调IL-8、TNF-、热休克蛋白70和酸性糖蛋白的水平，因此RI11有望作为抗生素的替代品，减少热应激对肉鸡的不良影响。 此外，研究发现，在饲料中添加后生元可以改善兔子的新陈代谢状态，提高其品质。 基于后生元的功能特性和安全性，有望成为一类新的、安全的饲料添加剂。
1.5 其他
后生元除了对宿主健康具有多种作用外，在食品贮藏、食品包装和生物膜控制方面也有很好的应用前景。 由于后生元对温度、氧气等环境具有很高的耐受性，因此对运输和储存条件没有限制，这使得它们在食品工业中的应用更加广泛。 在食品中加入后生元，不仅增加了食品的益生元功能，而且抑制了病原菌，起到了防腐作用，从而达到“多效融合”。 后生元的防腐作用主要与其成分中所含的细菌素、胞外多糖、短链脂肪酸等抗菌活性物质有关。 根据产品的类型，可以通过两种方式添加后生元：混合和喷洒，测试表明这两种方法都能有效抑制病原菌。 也有研究发现，后生元可以缓解食物过敏症状。 后生元还可用作包装纸的原料，浸渍细菌纳米纤维素制备新型抗菌纳米包装纸，并用作生物膜控制的抗菌膜剂。 虽然后生元比抗生素和化学防腐剂有一定的优势，但存在抗菌谱窄、生产成本高等问题，成为其应用中不可忽视的因素。
后生元的制备及鉴定方法
2.1 一种后生元的制备方法
后生元的制备遵循灭活细菌和保持有益特性的原理。 其制备方法包括高温、高压、酶处理、超声波、伽马辐射、溶剂萃取、超临界流体技术、喷雾干燥和冷冻干燥。 高温是后生元制备的常用方法，工业生产中一般采用高温灭活法，选取的优质菌株经特殊培养和热封技术处理，得到后生元制剂。 当使用高温灭活细菌时，时间和温度取决于细菌本身的耐热性和测试所需的益生元的特性。 细菌的高温灭活操作简单，但对有益物质的活性有一定的影响，因此研究人员开发了不进行热处理的方法。 Li等人将植物乳杆菌C88与溶菌酶在37孵育30 min，然后进行超声裂解，然后离心除去细胞碎片，得到上清液作为植物乳杆菌的后生元制剂。 活性物质的提取可以根据其性质进行，如有机溶剂提取多糖或大分子蛋白质，超临界流体技术提取糖脂等。 益生菌发酵液经灭菌处理，再经喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉，可提高产品的循环和便利性。 针对制备方法的多样性，根据菌株特点和后生元的健康使用，选择了一种快速、可控、经济的制备方法。
2.2 后生元成分的分析鉴定方法
后生元不是一种单一的化合物，而是多种成分的混合物。 虽然后生元已被证明具有多种作用，但对发挥特定作用的活性成分的分析和作用机制是后生元研发中需要解决的问题。 后生元成分的鉴定方法复杂多样，常用的鉴别方法有气相色谱、液相色谱、气相色谱-三重四极杆串联质谱、液相色谱-三重四极杆串联质谱、薄层色谱、核磁共振波谱、傅里叶变换红外光谱、分光光度法、扫描电子显微镜和原子力显微镜、拉曼光谱光谱学、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等鉴定方法的选择取决于后生元的研究目标和所追求的表征类型（定性或定量）。 GC和GC-MS是用于短链脂肪酸、挥发性化合物（如二乙酰基、丙酮和二甲基砜、2-丁酮）和有机化合物的定量和定性分析最常用的分析工具。 LC和LC-MS也是鉴定后生元化学成分的常用方法，可以准确、系统、快速地鉴定。 Gao等人通过LC MS-MS分析从鼠李糖乳杆菌的GG发酵上清液中鉴定出一种新的分泌蛋白（HM0539）。 研究人员还通过超高效液相色谱-高分辨质谱法鉴定了嗜酸乳杆菌和加氏乳杆菌发酵上清液中的97种代谢物和71种脂质。 此外，Fuochi 等人使用 NMR 波谱来检测和定量不同乳酸菌株产生的无细胞上清液中的代谢物（例如氨基酸、有机酸、单糖、酮和醇）。 MALDI-TOF是一种用于鉴定后生元制剂中蛋白质成分的新工具。 TLC、FTIR和分光光度法都是快速定性检测方法。 拉曼光谱可以检测细菌成分的生物活性。 扫描电子显微镜和原子力显微镜主要用于表征大分子物质的理化性质。 由于后生元成分的复杂性，鉴定方法通常是多种技术的组合。
后生元的工业应用
ISAPP关于后生元的官方声明指出，后生元的上市产品必须满足以下条件：1）细胞微生物的分子表征（如完整的基因组序列），以准确识别和筛选潜在的安全隐患基因;2）详细描述灭活步骤和程序;3）确认已发生灭活;4）成分的详细说明;5）进行高质量的试验，并有真实世界的证据证明对宿主的健康益处;6）评估其制剂在目标宿主中的预期用途及其安全性。在充分的科学研究和临床试验的支持下，后生元产品的商业化路径发展迅速[8]。 罗伊氏乳杆菌 DSM 1768 的灭活对幽门螺杆菌 H 有效幽门螺杆菌），其作用原理是灭活幽门螺杆菌中宿主胃的细菌幽门螺杆菌特异性结合，掩盖 H幽门螺杆菌表面结构与H形成灭活细菌幽门螺杆菌，可防止其粘附在胃粘膜上并排出体外。 多项研究证明，热灭活植物乳杆菌L-137，包括灭活细菌和代谢产物，具有调节免疫系统、维持肠道菌群平衡和改善干燥度的功能，产品已广泛应用于饮料、面包、糖果、拉面等食品中。 目前后生元的工业应用见表2。
表2后生元的工业应用
table 2 industrial appication of postbiotics
展望
2020年8月20日，中国食品科技学会发布“益生菌科学研究十大热点”，《益生菌与后生元》位列其中，并首次入选后生元，说明科研界对后生元寄予厚望。
作为一个新事物，后生元在其研究和应用领域仍有许多问题需要解决。 例如，对后生元中发挥特定作用的效应分子进行分析鉴定，并阐明其作用机制。 后生元的疗效评价和安全性仍需通过大量临床试验进行验证。 法律法规和标准的滞后以及消费者的认知在一定程度上限制了后生元的商业化发展。 尽管如此，后生元的“多功能性”和安全性、稳定性的优势使其在食品、保健品、医疗、化妆品、饲料等多个领域具有巨大的市场潜力。 未来，“后生元产品”和“后生元**”可能会成为大众的“首选”。
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