背景：
自2013年获得诺贝尔奖以来，外泌体一直是国际科学界的研究热点。 近十年来，它的受欢迎程度一直居高不下，如今依然稳居全国自然热点排行榜第五位！ 让我们继续揭开这个细胞外囊泡的神秘面纱吧！
外泌体个人名片：
名字：外泌体 ;
物种：细胞外囊泡;
大，小：直径30-150nm;
密度：1.1-1.18g/ml；
形状： “碟形”;
源：：由所有活细胞分泌;
存在：存在于几乎所有组织、细胞间隙、体液中;
数量：在人体内大约有1014个，平均每个细胞差不多有1000-10000个;
功能：调节细胞代谢、控制炎症、促进血管生成、促进组织修复、免疫调节、癌症发生发展、抗原呈递等
荣誉：2013年诺贝尔生理学或医学奖获得者。
携带物质：脂质、蛋白质、DNA 和 RNA（miRNA、LNCRNA、环状 RNA、mRNA）;
突出特点：异质性，即同一细胞分泌的外泌体可能具有很大的功能差异;
图 外泌体结构及特点。
外泌体的性质及相关应用：
1.异质性，可作为疾病诊断的生物标志物
不同细胞分泌的外泌体在数量、细胞膜和内容物组成、生物学功能等方面存在差异，且具有异质性。 外泌体的大小和含量可以反映分泌细胞的类型和状态，并能准确调节体内的各种生理活动，可作为疾病诊断的生物标志物。 通过分离和纯化体液中的外泌体，分析其中所含的特征性mirNAs或蛋白质，然后将其与疾病特征标志物进行比较，可以确定疾病的类型。
存在，可用于免疫调节
外泌体通常通过递送多种生物分子来完成抗原呈递、免疫激活抑制和免疫耐受的过程。 其中，抗原呈递细胞分泌的外泌体可以携带和呈递相关复合物，通过减弱或增强免疫反应来达到免疫的目的。 此外，外泌体负载着许多免疫相关分子，包括溶酶体相关膜蛋白 1 和 2、免疫球蛋白超家族成员 8 和 MHC，它们可以特异性结合相关肽链并诱导免疫反应。
3.去免疫，可作为药物递送载体
外泌体的特点是免疫原性低，可以逃避大多数免疫系统的识别和攻击。 与传统化学药物的生物相容性差、易被人体清除、溶解性和通透性差等缺点相比，外泌体具有纳米级体积、细胞毒性低、生物膜通透性和生物相容性好等诸多优点，其脂质双层膜结构可以保护内容物不被降解，保持生物活性。 因此，外泌体可以作为载体递送药物，帮助药物逃避免疫系统，跨越组织屏障，提高药物递送和吸收的效率。
4.致瘤性强，可应用于肿瘤**
肿瘤细胞**外泌体的致瘤原促进性质表现为调节机体免疫功能，同时也向受体细胞传递有害信息，导致细胞病变; 此外，肿瘤细胞会分泌外泌体，将部分药物排出细胞或与功能性药物抗体结合，降低药效和耐药性。 许多研究表明，晚期肿瘤细胞分泌的外泌体可以抑制抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤的生长和扩散。 近年来，外泌体在肿瘤应用中产生了许多新的干预措施，例如阻断外泌体的产生、分泌和阻断外泌体介导的细胞通讯。
5.诱导性强，可应用于再生医学
外泌体还具有诱导细胞**和分化的功能，可以促进间充质干细胞（MSCs）分化为不同的细胞，以替代受损的组织细胞，用于再生医学领域。 例如，从人脐带间充质干细胞的条件培养基中提取的外泌体可以促进细胞的增殖和迁移，抑制线粒体凋亡信号通路，从而促进第一伤口的修复。 多家公司开发了基于外泌体的再生医学产品，涵盖伤口再生、药妆产品、美容等领域。
外泌体研究整体方法：
图：整个外泌体研究方案的流程图。
外泌体鉴定：
在上一期文章《国家自然研究热点“常青树”——外泌体简介》中，我给大家详细介绍了外泌体提取纯化的各种方法。 外泌体分离纯化后，需要进行表征，以确定纯化效果，并评估所得的外泌体是否满足下游实验的需要。 外泌体的表征和鉴定方法很多，分析的指标也是多方面的尺寸、形态、表面标记这三个方面的检测是最重要的，是国际细胞外囊泡学会（ISEV）推荐的用于表征分离外泌体的方法。
1. 外泌体大小和形态学鉴定——电子显微镜
电子显微镜，如扫描电子显微镜（SEM）或透射电子显微镜（TEM）可以可视化颗粒的形态，因此可用于识别外泌体的存在和完整性。 操作步骤大致如下：将提取的外泌体用PBS重悬，滴在孔径为2nm的样品铜网上，室温静置2min，用滤纸吸收滤网侧面的液体，用3%磷钨酸溶液在室温下阴性染色5min， 滤纸吸收负性染色液，室温干燥，用电子显微镜观察拍照。外泌体在电子显微镜下具有非常明显的膜边界，是30至150nm不同尺寸的碟形或杯状结构（在200nm以下也有其他形状难以识别的外泌体）。
图：用于检测外泌体形态的电子显微镜。
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2.外泌体粒径浓度的检测——纳米颗粒示踪剂分析（NTA）。
NTA技术可以检测外泌体的粒径和数量，操作步骤为：将收集的外泌体用PBS稀释至106ml，用1ml注射器注入纳米颗粒跟踪分析仪; 激光束穿过样品室外的样品颗粒，通过配备相机的显微镜对颗粒进行可视化，捕获外泌体的布朗运动，最后利用方程根据其运动计算浓度和流体动力学直径。 与其他外泌体鉴定方法相比，NTA技术具有更简单的样品处理，更好地保证了外泌体的原始状态，检测速度更快。
图 NTA检测外泌体粒径浓度。
3. 外泌体表面标志物的鉴定-WB检测
外泌体生化分析鉴定主要是检测其携带的特定蛋白标记物，WB检测是外泌体特异性蛋白（如四跨膜蛋白、肿瘤易感基因101蛋白、脂筏标记蛋白、凋亡诱导因子6相互作用蛋白等）的常用分析技术。 具体操作参考标准WB操作，采用外泌体特异性蛋白的抗体进行标记，从而定性检测分析外泌体。
图 WB 检测外泌体特征蛋白。
还有其他方法可用于鉴定外泌体，如ELISA、流式细胞术和质谱法，这些方法也常用于检测外泌体的数量和表面标志蛋白（如CD9、CD63和CD81）的表达。
外泌体定量检测试剂盒介绍：
ABSIN ELISA夹心检测试剂盒（ABS50054）采用高性能抗CD9捕获和抗CD81检测抗体检测人体液或细胞培养上清液，灵敏定量地检测共表达外泌体表面标志物CD9和CD81的靶标，实现对样品中完整外泌体的快速准确定量。
图 外泌体定量检测试剂盒的原理。
产品组成：
协议程序：
1.试剂制备
1）所有试剂在室温下至少15min平衡后使用;
2）取浓缩化妆水溶液，用蒸馏水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍工作液，混匀后备用;
3）显色底物溶液应在A和B之间按1：1混合后再检测。
二、实验过程
1）准备好板条，充分摇匀试剂;
2）用移液管取100 L标准SO-S5，并将待测样品加入微孔板中。
3）用密封膜密封板孔，37、60min;
4）将工作液洗涤3次，每次300-350升孔，将板孔内残液拍在吸水纸上;
5） 每孔加入 100 l 酶偶联物;
6）用密封膜密封板孔，37、60min;
7）洗涤工作液3次，每孔300-350升，用吸水纸拍干;
8）向反应孔中加入显色底物溶液工作液100 L，避光30min，加终止液50 L，在酶标仪上以450nm处读数，绘制XY线性曲线。
3. 校准程序
XY线性拟合，线性相关系数r 099.为每个实验做一整套校准器，并画曲线。
引用
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