在上一期《走进科学，走进基因突变》一文中，小艺带大家了解了基因突变的简单知识，相信大家对基因突变都有一定的了解。 作为当今生命科学的研究热点之一，检测方法也得到了快速发展，基因突变的检测可以促进疾病的早期诊断和**。 下面简要介绍几种常用的基因突变检测方法及其基本原理，可根据试验目的和实验条件选择参考。
一southern blot科技
Southern 印迹由英国生物学家 Edwin Southern 于 1975 年发明，并命名为 Southern 印迹，以纪念该技术的诞生。 该技术是最早出现的印迹技术，是分子生物学领域最常用的DNA检测方法之一。 其基本原理是，在一定条件下，根据碱基互补的原理，可以特异性地杂交具有一定同源性的两个核酸单链形成双链。 如果样品包含与探针互补的序列，则通过碱基互补原理将两者结合，然后用自成像或其他适当技术清洗和检测游离探针，以揭示待测片段及其相对大小（图1）。 因此，该技术成为探针杂交领域最经典的分子检测方法，并已广泛应用于各种基因突变和限制性片段长度多态性（RFLP）的鉴定。 有关Southern Blot的更多信息，请参阅实验技术“四大发明”中的文章“Approaching the Southern Blot， Northern Blot， and Western Blot”。
图1 Southern Blot工艺示意图（**来源：国家人类基因组研究所）。
第二PCR技术
对于基因突变的检测，在1985年之前，主要使用Southern Blot，它可以筛查基因缺失、插入和移码重组等多种突变。 由于当时无法人工扩增样本中的靶基因，那些无法通过Southern印迹检测的突变只能通过诱变引物的复杂DNA测序分析来确定，以在体外建立寡核苷酸介导的DNA突变，但这种方法不仅复杂，而且耗时长。 费力，成本高昂。随着聚合酶链式反应（PCR）技术的兴起，几乎所有用于基因突变检测的分子诊断技术都基于PCR，其自动化程度、分析时间和结果准确性都得到了进一步提高，PCR技术的出现是基因突变检测研究的一大进展。 下面小艺将介绍临床实践中几种常用的基因突变检测技术的原理。
1、arms-pcr扩增难治性突变系统 PCR （ARMS-PCR），也称为等位基因特异性 PCR （AS-PCR），基于等位基因特异性延伸反应，只有当等位基因特异性引物的 3' 端与突变位点碱基互补时才能进行。 ARMS-PCR已成为全球肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，也是诊断遗传病最准确的技术工具之一。
ARMS-PCR与普通PCR的区别在于，等位基因的两个上游引物的3'末端序列在引物设计时不同，在进行PCR扩增时，不能与模板完全匹配的上游引物将无法与模板完全形成互补碱基对， 形成错配，当错配达到一定水平时，引物延伸将被终止，并且不会获得特定长度的PCR扩增产物，从而表明模板DNA没有与引物的3'端配对的碱基，反之亦然（Peng et al. 2018）。目前，科学家已将Tetra-primer Arms-PCR方法扩展为同时设计四种PCR引物，其中两种位于3'SNP位点，方向相反，属于不同基因型，另外两种位于SNP的外部（图2）。
图2 四引物ARMS-PCR方法示意图（Ye et al.）。, 2001）。不同的颜色表示参与PCR反应的不同引物。
2. 数字PCR数字PCR（DPCR）是核酸分子的绝对定量技术，即第三代PCR技术，是生命科学和医学诊断的关键技术之一。 1999年，Bert Vogelstein和Kenneth WKin-Zler正式提出了数字PCR的概念。 当液滴中的靶标通过PCR扩增时，扩增完成后对各反应单元的荧光信号进行统计分析，荧光信号为1，无荧光信号为0，以获得供试样品中突变体和野生型的绝对定量，可检测到低至一拷贝的突变（图3）。
图3 典型的数字PCR工作流程方案（CAO et al.）, 2020）。
HRM高分辨率熔解曲线分析技术
高分辨率熔解曲线（HRM）由犹他大学分子病理学教授Carl Wittwer发明，是一种基于PCR技术的技术，用于检测和分型靶片段的基因变异。 HRM主要依靠含有饱和DNA双链荧光染料的PCR靶标片段、优化的靶标片段设计、能够有效控制温度获得高分辨率熔解曲线信号的仪器系统、熔解曲线软件分析系统。 该技术因其操作简单、检测成本低、速度快、PCR后无需开管、避免二次污染的机会、检测灵敏度高等特点，在医学等生物相关科学的各种基因检测中得到了迅速推广和应用。
HRM的主要原理是利用可插入PCR产物的饱和双链DNA（dsDNA）染料的特性，通过实时监测加热过程中DSDNA熔解、荧光染料脱落、荧光信号减弱或消失的过程，并以高分辨率记录熔解曲线，从而对单个碱基进行高分辨率的解析， 以及样本突变、SNP 和甲基化位点的高灵敏度分析。
图4 HRM原理检测等位基因表达失衡示意图（Nguyen-Dumont等）。, 2011）。
与其他检测基因突变的方法一样，HRM技术也存在一定的局限性，例如难以识别未知突变位点，并且检测灵敏度受检测到的基因片段的SNVS类型的影响。 然而，该技术的优势正好符合当前个体靶向分子诊断的需求。 该技术不仅像其他以靶基因片段为检测靶点的基因检测方法一样具有灵活性、快速性、灵敏度高、成本低等优点，而且可以实现所有基因变异类型的检测，并能灵活地提高检测通量，节省检测样本量、检测时间和成本， 并降低污染风险，以满足临床测试的需要。
4.等温放大技术与传统PCR相比，它不需要热循环仪器，具有快速灵敏、简单便携、特异性强等优点，在分子诊断方面具有很好的应用前景，特别是在床旁检测和现场筛查方面。 其基本原理是利用杂链取代酶、聚合酶、RNA切割酶等多种酶，基于环状DNA扩增机理，在恒温条件下完成DNA扩增过程。 在等温扩增过程中，通过设计合适的引物，可以在RNA剪切酶的作用下生成不同长度的RN**片段。 通过检测这些RN**片段，可以分析DNA序列中的特定突变（Boonbanjong等人, 2022）。
图5 PCR和一些IAT系统的示意图（Boonbanjong等人）。, 2022）。
随着生物科学和技术的发展，IAT衍生出多种技术，如环介导的等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）和基于核酸序列的扩增（NASBA）、解旋酶依赖性等温DNA扩增（HDA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、切口酶扩增（近）、链置换扩增（SDA）、杂交链式反应（HCR）等技术， 由于篇幅有限，本文不再详细讲解各种技术的原理和应用，对IAT感兴趣的同学可以查阅相关资料进行学习。
有关PCR技术的更多信息，请参阅“您真的可以区分PCR，QPCR，RT-PCR，RT-QPCR和实时荧光定量PCR吗？ 品。
3.基因测序方法
基因测序的本质是利用基因测序仪确定基因上四个碱基（a、t、g、c）的顺序，具体原理是用不同颜色的荧光标记基因中的四个碱基，利用基因测序仪中的激光系统，按照碱基排列的顺序依次激发碱基发出荧光， 不同类型的荧光颜色不同，使用特殊的相机来捕获荧光信号，以确定基因上碱基的顺序。随着科学技术的进步，基因测序已经从第一代测序发展到后来的第二代测序（NGS），再到现在的第三代测序（TGS）。
1. 第一代测序1977年，桑格和吉尔伯特分别提出了双脱氧链终止法和化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。 其中，桑格双脱氧链终止法（即桑格测序）是最经典的第一代测序技术之一，也是应用最广泛的基因突变检测方法之一，而化学降解法则逐渐被遗忘。 Sanger 测序通过用特异性引物靶向模板 DNA 的特定区域，将双脱氧核苷酸 DDNTP 添加到 PCR 反应中，通过电泳分离细长产物，并检测荧光标记以获得每个位置的碱基信息来分析 DNA 序列中的特定突变（图 6）。 作为测序的“金标准”，Sanger测序比NGS和TGS具有更高的测序准确度，700-1000bp读长的准确度高，可以很好地处理重复。 缺点是一次只能检测到一个模板，速度慢且耗时（Zhang et al.）。, 2021）。
图6 Sanger测序过程（Zhang et al.）, 2021）。
2. 二代测序二代测序（NGS）是基于PCR技术和基因芯片，采用大规模并行测序技术，可以合成具有数百万条互补链的测序模板，同时获得序列数据。 NGS主要采用随合成测序（SBS）技术和边缘连接测序（SBL）技术。 目前，Illumina测序系统已成为NGS的主流。 NGS通过捕获DNA复制过程中新添加的碱基携带的特殊标记物（通常是荧光分子标记物）来确定DNA的序列，整个过程可分为四个主要步骤：文库制备、DNA簇生成、边合成边测序和数据分析。 NGS具有高通量和短读长两个重要特点，其高效率和低成本的单碱基测序为临床应用提供了不可估量的优势。
3. 三代测序三代测序（TGS），又称从头测序技术，是测序技术的一个里程碑，是在单分子测序（SMS）和大规模平行测序技术的基础上开发新技术。TGS主要包括Pacbio技术和Nano Pore技术（Athanasopoulou et al.）。, 2021）。例如，在纳米孔系统的情况下，纳米孔蛋白被固定在电阻膜上，当核酸通过纳米孔时，这会导致电荷发生变化。 由于纳米孔的直径非常小，只允许单个核酸聚合物通过，不同的碱基在通过蛋白质纳米孔时会干扰电流，并且可以通过实时监测和解码这些电流信号来确定碱基序列。 TGS具有测序读长、原始DNA样品直接测序、RNA和甲基化DNA序列直接检测、操作快等优点。
四、杂交法
荧光原位杂交
1986年，科研人员开始利用异硫氰酸荧光素标记探针，并在荧光显微镜下观察分析，建立了荧光原位杂交（FISH），即根据碱基互补配对的原理，将外源核酸（即分子探针）与DNA或RNA配对，在组织和细胞上进行检测，形成核酸杂交分子。 用报告分子（例如生物素、地高辛）标记核酸探针的核苷酸，可以利用报告分子与荧光素标记的特异性亲和素之间的化学反应，使探针信号被荧光显微镜捕获，以分析待测样品中是否存在基因突变。
2.基因芯片基因芯片技术是90年代中期以来发展迅速的高科技分子生物学技术，是一门融合了各学科的新兴科学，目前主要应用于疾病诊断和药物研究。 其主要原理是通过与一组已知序列的核酸探针杂交来确定核酸序列的方法，并将具有已知目标核苷酸序列的探针固定在底物表面。 当溶液中带有荧光标记的核酸序列tatgcaatctag与基因芯片上相应位置的核酸探针匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，可以得到一组序列完全互补的探针序列，并可以重新组合目标核酸的序列。
引用
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