本文重点介绍利用微生理系统研究脂肪肝及其对药物性肝损伤的影响。
来自制药公司阿斯利康的研究团队利用CN Bio Physiomimix构建了脂肪肝模型，研究了脂肪肝模型中各种代谢酶活性的差异以及多种肝毒性风险较强的药物对脂肪肝疾病的损害性能（各指标的变化）。
由于糖尿病、肥胖症和代谢综合征的患病率增加，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）现在是发达国家常见的慢性肝病（1）。 NAFLD的病理范围从良性肝脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），可导致肝硬化和肝癌。 目前尚无FDA批准的NAFLD NASH药物，显然需要更好的模型来了解这种疾病。
此外，人们越来越意识到由于内在代谢状况导致的药物性肝损伤 （DILI） 的潜在危险因素。 NAFLD患者的DILI可能以两种不同的方式恶化：一些药物似乎会加剧先前存在的NAFLD，导致细胞内脂质积累过多，而另一些药物则更频繁地诱发急性肝炎和肝损伤（2）。 有人提出，肥胖患药物性急性肝炎的风险更高，并且与几种细胞色素 P450 （CYP） 物种的活性增加有关，从而增强有毒代谢物的产生 （2）。 当过量产生时，反应性代谢物可引起肝脏氧化应激、严重的线粒体功能障碍和细胞溶解。
然而，这些过程发生的机制知之甚少，并且由于肥胖症的流行，脂肪肝引起的药物不良反应变得越来越普遍。 因此，我们开发了一种先进的体外模型来探索DILI和NAFLD的关系和机制。
CN-Bio Microphysiological Systems （MPS） 开发了一种完整的人类体外灌注 NAFLD 模型，该模型利用 3D 培养的原代人肝细胞 （PHH） 来模拟肝脏的微观结构。 用高浓度的游离脂肪酸培养细胞长达四周，以诱导细胞内甘油三酯（脂肪）积累并模拟肝脏脂肪变性。 研究了该模型中细胞中CYP酶活性的变化以及已知肝毒性药物在IC：50浓度附近给药时的影响。
来自赛默飞世尔（美国）的原代人肝细胞 （PHH） 的冷冻保存可播种板。 将 0将 6 x 106 的肝细胞接种到 Physiomimix OOC LC-12 板 （CN Bio Innovations Ltd） 的每个孔中，并在含有生理相关葡萄糖、胰岛素和高浓度饱和不饱和游离脂肪酸的 HEP-Lean 或 HEP-FAT 培养基中培养。 细胞在 Physiomimix 平台上培养长达 18 天（图 1）。
A） 体外模型利用 PhysioMimix OOC 细胞培养系统，该系统使用开孔板设计，用于在工程支架中以 3D 方式培养原代肝细胞。b） LC-12肝芯片板上单个培养孔的示意图。c） LC-12多孔板示意图。d） 在整个实验过程中，用固定在板上每个孔中的支架连续灌注细胞培养基，以提供生物力学刺激和氧气** （3）。E） 通过在高脂肪培养基中培养 PHH 长达 28 天来生成 NAFLD 模型。为了研究迪力，仅在脂肪负荷 14 天后给予复合剂量。
通过固定微组织的油红O染色测量脂肪堆积，并在Nikon Eclipse Ti-E倒置荧光显微镜上获取图像（图2）。 通过515nm处的吸光度对染色进行定量，并归一化为通过BCA测定（ThermoFisher）测定的总蛋白质含量。 通过ELISA（RD系统）测量白蛋白的产生，使用Cyto-Tox96测定（Promega）定量LDH释放，并使用细胞滴度GLO测定（Promega）评估细胞活力。
图2 人原代肝细胞中细胞内脂肪随时间推移的积累。 在高脂肪培养基中培养的基因表达谱发生改变。
PHH在高脂和无脂条件下培养14天。 通过微组织的油红O染色测量脂肪负荷，并使用Liver RT2 Profiler PCR阵列比较基因表达。 A） 对细胞内脂肪积累进行成像，b） 通过 510 nm 处的吸光度定量并归一化为总蛋白质含量。c） 通过 ELISA 量化白蛋白的产生，以及低脂和高脂肪培养物之间的基因表达变化 d） 通过倍数变化 18 和 p 005 划定标准。 e） 高脂肪与低脂肪条件下关键基因表达的倍数变化。数据是来自 9 个独立培养物的平均 SEM（每个病例 3 个供体，每个供体 n = 3 个样本）; *p ＜0.05。数据取自 Kostrzewski 等人之前发表的 2017 年 （3）。
对于转录组分析，使用Trizol从支架中提取总RNA。 使用RT2分析仪阵列（QIAGEN）生成并比较cDNA样本，该阵列对脂肪肝相关基因具有特异性。使用两种方法评估 CYP 活性; 使用CYP3A-GLO实验（Promega）或LC-MS对特定化合物浓度进行定量。 简而言之，细胞暴露于一系列对不同 CYP-450 酶具有特异性的化合物。 使用以下化合物：非那西丁（CYP1A2）、双氯芬酸（CYP2C9）、S-甲基苯妥英（CYP2C19）、丁呋洛尔（CYP2D6）、Mida**（CYP3A4）和氯唑酮（CYP2E1）。 每种化合物将以 1 M 的起始浓度施用 48 小时，使用 01 DMSO 作为溶剂。 使用LC-MS定量细胞培养基样品中每种化合物的I期代谢物的产量。
图 3 – PHH 在高脂条件下培养 14 天，然后添加探针化合物以评估关键 CYP-450 酶的代谢活性。
通过在48小时内产生I期代谢物来确定每种酶的活性。 使用LC-MS和代谢物标准曲线定量代谢物的存在。 所有化合物均在第 14 天给药，但 CLZX（CYP2E1 靶标）除外，该化合物在第 7 天给药。 每个数据至少为 n = 3。 * = p <0.05。
图 4 – 在低脂培养基条件下，在胶原包被的 96 孔板上培养 PHH 72 小时。
将细胞暴露于不同浓度的a）对乙酰氨基酚，b）甲氨蝶呤和c）噻氯匹定48小时，然后使用Cell Titre GLO评估细胞活力。d） 为每种化合物生成 IC：50 值，并将其与已发表的数据进行比较 （4）。显示的数据是 MEAN SD，最多。 小是 n = 4。
图 5 – 将 PHH 在高脂质条件下孵育 14 天，然后在先前测定的 IC：50 浓度附近加入化合物。
将每种化合物以单次48小时或两次48小时（多次）剂量施用到PHH微组织中。 施用的每种化合物稀释在含有01 DMSO 溶剂在低脂培养基中。 对照低脂和高脂微组织仅用溶剂给药。 通过测量细胞培养基中的LDH释放，细胞培养基中的白蛋白产生以及确定施用不同化合物后肝细胞中的CYP3A4活性来评估细胞健康。 数据为平均SD，n = 4。 * = p <0.05。
使用MPS平台PhysioMimix，我们生成了NAFLD的人体体外模型。 PHH 在含脂肪培养基中培养，该培养基在临床疾病的早期阶段诱导关键特征，包括细胞内脂肪负荷、白蛋白生成增加以及关键基因（包括参与代谢和胰岛素抵抗的基因）表达的变化。 我们进一步研究了脂肪负荷后PHH的代谢活性，以确定细胞内脂质积累如何调节CYPase的活性。 模拟体内（临床）观察 （2），我们看到各种酶的增加，包括：CYP1A2、CYP2C9 （1.）5 倍）、CYP2C19（2 倍）和 CYP2E1（2 倍）。5倍）活动。此外，我们观察到脂肪负荷后 CYP3A4 活性略有下降。 通过在体外NAFLD模型中评估对乙酰氨基酚、噻氯匹定和甲氨蝶呤的毒性，研究了这些代谢变化对肝细胞对DILI敏感性的影响。
对乙酰氨基酚和噻氯匹定在脂肪负载细胞中引起更过度的DILI反应，导致LDH释放增加，白蛋白产生减少和CYP3A4活性降低（作为细胞活力的衡量标准）。 当化合物多次施用到肝组织时，这些变化通常更为明显。 显示。 在存在脂肪负载肝细胞的情况下，甲氨蝶呤给药似乎不会引起 DILI。 总之，这些数据展示了MPS平台和相关的NAFLD模型如何在早期阶段捕获关键特征，并展示了一系列临床观察到的对DILI的反应。
该方法将成为分析新化合物的毒性特征以及它们在不同患者亚群中的行为（引出 DILI）的有用工具。
1.friedman sl, neuschwander-tetri ba, rinella m, et al. nat med 2018;24:908-922.
2.fromenty b. drug-induced liver injury in obesity. j hepatol 2013;58:824-6.
3.kostrzewski t, cornforth t, snow sa, et al. world journal of gastroenterology 2017;23:204-215.
4.proctor wr, foster aj, vogt j, et al. arch toxicol 2017;91:2849-2863.
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