单细胞测序技术可用于检查单细胞的基因组、转录组和其他多组学。 单细胞测序技术可以揭示各种细胞的差异和进化关系。 本文介绍了单细胞测序技术的最新进展及其在肿瘤学、微生物学、神经学、生殖学、免疫学、消化学和泌尿学中的应用，强调了单细胞测序技术在这些领域的重要作用。
单细胞测序技术是指对单细胞基因组或转录组进行测序，以获得基因组、转录组或其他多组学信息，以揭示细胞群差异和细胞进化关系。 传统的测序方法只能获得许多细胞的平均值，而无法分析少量细胞，从而丢失了细胞的异质性信息。 与传统的测序技术相比，单细胞技术具有检测单个细胞之间的异质性、区分少量细胞和分析细胞的优势。 2024年，它被评为年度“自然方法”技术。 然而，早期的单细胞测序由于成本高昂，限制了其广泛使用。 然而，随着研究的进展，许多新的单细胞测序方法被开发出来，降低了单细胞测序的成本门槛。 如今，单细胞测序技术在各个领域的应用越来越多。 本文介绍了单细胞测序方法的最新进展及其在肿瘤学、微生物学、神经学、生殖学、免疫学、消化学和泌尿学中的应用，阐明了单细胞测序技术在基础和临床研究中的重要作用。
接下来，我们来看看单细胞测序方法及其最新进展。
一单细胞测序方法的开发
随着研究的不断推进，单细胞测序方法（图1）的能力不断提高，朝着降低检测成本的方向发展，促使科学家在单细胞水平上研究分子机制。 Vitak等人提出了一种单细胞组合标记测序技术（SCI-Seq），该技术可以同时构建数千个单细胞文库并检测体细胞拷贝数的变化（图1）。 该技术增加了检测到的细胞数量并降低了文库构建的成本，这在体细胞变异研究中具有重要价值。 Chen博士等人开发了一种新的单细胞全基因组扩增方法，可以以千碱基分辨率检测CNV，并更有效地检测更多疾病的突变（图1）。 郭博士等人开发了一种单细胞多重测序技术（SCCoo-Seq），可以同时分析单细胞染色质状态、核生态位定位、拷贝数变异、倍性和DNA甲基化，可以指示染色质状态和DNA甲基的不同功能和模式（图1）。 Casasend等人发明了一种拓扑单细胞测序（TSCS），为细胞提供准确的空间位置信息（图1）。 该技术在空间上精确测量和表征单个肿瘤细胞的特定特征，有助于研究肿瘤细胞的侵袭和转移。 Demaree 等人描述了一种高通量、低偏差的单细胞测序 （SiC-Seq） 方法，该方法使用液滴微流控技术对单个细胞的基因组进行分离、扩增和条形码编码（图 1）。 这种方法可以对不同的细胞群进行更广泛的基因组研究。 Microwell-Seq 由 Han 等人开发，是一种高通量、低成本的 ScRNA-Seq 平台（图 1）。 它不仅提高了单细胞技术的检测丰度，而且与涂有油滴的单细胞测序技术相比，检测成本降低了一个数量级。 Rosenberg等人的Split-Seq技术基于低成本组合条形码的原理，可以将单细胞转录组测序的成本降低到1%。 再一次，单细胞检测的成本阈值被打破（图1）。
图1单细胞测序的原理。 它是分离单个细胞进行测序和研究细胞异质性、分子定位、免疫浸润和表观遗传变化的过程
第二联合使用单细胞测序技术
单细胞测序检测成本的降低有利于其他技术与单细胞测序技术的结合，大大提高了单细胞检测的效率。 Datenger等人将CRISPR筛选与单细胞RNA测序相结合，发明了Crop-Seq（图1），能够对复杂的调控机制和异质细胞群进行高通量功能分析。 Habib等人将SNUC-Seq与微流控技术相结合，引入了一种低成本、高灵敏度、高效率的单细胞核RNA测序方法进行细胞分选，有望用于人类细胞图谱项目（图1）。 Lake等人将单核测序（sndrop-seq）和单细胞转座子超敏反应位点测序（SCTHS-seq）相结合，创建了一个高通量测序平台，用于平行检测核转录本和表观遗传特征（图1）。 它为全面分析冷冻保存的人体组织样本中的基因表达和调控提供了途径。
以上研究（图1）表明，单细胞测序技术不断更新和发展，为构建完整的细胞图谱提供了技术基础，极大地推动了单细胞研究的进程。 未来，融合多组学方法的单细胞测序技术可能会流行起来，并在复杂器官和组织的单细胞研究、临床疾病诊断和**中发挥越来越强大的作用。
第三单细胞测序应用
癌症的应用
研究表明，遗传或基因组变异会导致肿瘤组织内的细胞具有不同的遗传和表型特征，从而使肿瘤组织具有高度异质性。 这种高度的异质性可能与肿瘤发生和转移的机制有关，因此研究人员需要对肿瘤细胞进行更准确的分析。 传统的测序方法只能检测细胞群并给出一组细胞中信号的平均值，但它们也掩盖了肿瘤细胞的异质性。 因此，传统的测序方法不能很好地研究肿瘤细胞。 单细胞测序技术可以完美地弥补传统测序方法的不足。 通过检测肿瘤细胞的异质性，绘制肿瘤细胞的细胞和肿瘤微环境，进一步阐明肿瘤组织内的细胞群，寻找特异性标志物，解释肿瘤发生和转移等一系列问题。 因此，单细胞测序技术广泛应用于各种肿瘤的研究，对开发新的诊断和抗肿瘤**方法具有重要意义（图2）。
图二单细胞测序在癌症、免疫系统、生殖系统、微生物等不同领域的临床应用。 这将有助于澄清一些问题，并为找到更好的方法提供基础
结直肠癌
张博士团队利用单细胞测序技术对结直肠癌T细胞的免疫受体进行定位，揭示了结直肠癌T细胞的亚群分类、组织分布特征、肿瘤异质性和药物靶基因表达。 确定了T细胞群与组织中分布的亚群之间的潜在状态转移关系。 同年，卞等人利用该技术从单细胞分辨率和多组水平分析了人结直肠癌在癌症转移过程中基因组拷贝数变异、DNA甲基化异常和基因表达变化的特征和相互关系。 上述研究对于揭示人类结肠癌的新机制，提高癌症的诊断和水平具有重要意义。
乳腺癌
癌症的起源和转化
乳腺癌是一种由乳腺上皮细胞基因改变引起的高度异质性疾病。 Nguyen等人利用单细胞测序技术绘制了人乳腺上皮细胞的单细胞模式图谱，分析了乳腺细胞中细胞类型的多样性和状态。 这些发现有助于了解癌症的早期起源，并为提高癌症的早期发现和预防癌症进展提供基础。 Casasend等通过地形单细胞测序报道了癌症的多克隆起源以及导管原位癌与侵袭性癌的转化机制。 该研究揭示了原位肿瘤亚群和侵袭性肿瘤亚群之间的直接基因组谱系。 此外，还进一步证明了亚克隆的时间和原因，以及导管内克隆到邻近组织导致浸润性癌形成的机制。 本研究结果为预防早期癌症侵袭性提供了理论依据。
乳腺癌微
单细胞技术探索癌症的免疫微环境，发现免疫变化。 Azizi等人绘制了乳腺肿瘤微环境中各种免疫细胞的单细胞图谱。 通过该图谱分析了人乳腺肿瘤及其配对的正常组织、淋巴结组织和外周血的基因表达特征。 研究发现，瘤内淋巴细胞和骨髓细胞的异质性可以通过环境刺激诱导联合基因表达。 基于T细胞受体（TCR）和T细胞匹配的单细胞RNA测序数据，T细胞在癌症中的持续活化特征与巨噬细胞的极化模型不一致。 该研究检查了癌症的微环境，有助于区分其免疫细胞，并确定了肿瘤浸润免疫细胞中基因表达的差异以及差异的原因。
3.3 雌激素乳腺癌
研究人员观察到雌激素与乳腺癌之间存在密切关系。 雌激素激活雌激素受体 （ER） 以推动癌症进展。 朱博士团队通过单细胞转录组测序研究了雌激素信号通路和ER调控转录的机制，发现了雌激素刺激后ER阳性乳腺癌细胞的动态转录异质性。 该研究揭示了雌激素介导的乳腺癌单碳、嘌呤和多胺合成的代谢途径，并发现 PPAT 和 AZIN1 是癌细胞存活和生长的直接 ERA 靶点。 它补充了癌症的发病机制，为肿瘤靶向药物的研究提供了理论依据。
脑肿瘤
星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤通常被认为是不同类型的细胞。 然而，Venteicher 等人通过单细胞测序技术发现 IDH 突变胶质瘤具有共同的起源。 它们之间的差异主要是遗传学和肿瘤微环境组成的差异。 两种不同亚型的肿瘤通常具有相似的干细胞程序，可以与相似的神经胶质细胞质谱系统区分开来。 Tirosh 等人通过单细胞分析鉴定了人类少突胶质细胞瘤中的癌症干细胞及其分化后代。 这些发现支持了癌症干细胞假说，并证实了癌症干细胞是少突胶质细胞瘤生长的主要原因**。 这些研究表明，这些细胞可能成为新的靶标。 研究人员Suvà认为，免疫**可用于攻击特定的细胞类型，从而终止肿瘤生长。 这对这类疾病具有重要意义。
头颈部鳞状细胞癌
Puram等利用单细胞测序技术分析了头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的生态系统，绘制了头颈部肿瘤的第一幅细胞图谱，揭示了头颈部肿瘤的类型及其转移相关程序。 本研究为肿瘤转移的病因和转移提供了新的认识，有助于寻找阻断肿瘤转移的新靶点。
血液肿瘤
单细胞测序技术有助于寻找异质性异质性肿瘤的分类标志物，分析疾病发生的原因，为临床诊断和**疾病**提供理论依据。
Ledergor等人发现，在单细胞水平上，不同骨髓瘤浆细胞样本中的某些基因存在共表达和差异。 通过这些常用表达式可以找到新的标记。 样本之间基因表达模式和染色体结构的差异可能是骨髓瘤浆细胞高度异质性的原因。 该研究总结了单细胞方法在骨髓瘤诊断**和预后中的积极作用。 外周血用于区分肿瘤细胞和诊断疾病。 它不仅方便了样本的采集，而且减轻了患者在样本采集过程中的痛苦。
在急性白血病的研究中，Ley等人鉴定了与AML相关的基因，并测量了每个肿瘤样本中细胞的九个突变。 结果表明，这些由基因突变引起的异质性可能与发病机制有关。 Hou等对JAK2阴性骨髓增生性肿瘤患者的细胞进行了全外显子组单细胞测序，结果显示肿瘤代表了单克隆进化。 他们进一步确定了与原发性血小板增多症（ET）相关的候选突变，并推测这些突变可能与肿瘤进展有关。 De Bie等人通过靶向单细胞测序证明了T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的突变序列，T-ALL的发育可以在多能干细胞祖细胞中开始。
肝癌症和肺癌症
中国研究人员在单细胞水平上绘制了癌症微环境的免疫图谱和癌T细胞的免疫图谱。 揭示了癌症和癌免疫细胞的亚群分类、组织分布特征、肿瘤异质性以及药物靶基因表达。 这些研究有助于了解癌症和癌症的免疫微环境，并寻找有效的生物标志物、新的免疫肿瘤学**和药物靶点。 它对癌症和癌症的诊断和**具有重要意义。
尽管世界上有大量的微生物，但研究人员只研究了其中的一小部分。 由于大多数微生物的样本量极小且难以培养，因此研究微生物基因组的结构非常困难。 然而，单细胞测序的出现在微生物学领域取得了重要突破。 单细胞测序技术提供了传统细菌全基因组研究所缺乏的细胞特异性遗传信息。 它还发现了与细菌生命活动相关的基因，并通过基因组模型对微生物进行了分类。 Lan等对细菌和真菌合成群落进行高通量单细胞基因组测序（SIC-Seq），分析了抗生素耐药基因、毒力因子和噬菌体序列在环境微生物群落中的分布。 这项研究使得用单细胞对原核生物中的微生物进行测序成为可能。 未来，该技术可能会分离出低滴度病原体样本，并在单细胞水平上对其进行测序，以检查毒力基因型**。 根据上述研究，单细胞测序技术在微生物的分类、进化和抗性中起着重要作用。 它有助于挖掘有意义的环境微生物，并找到对抗抗菌素耐药性的方法。
4.在神经系统中的应用
神经元细胞分型
在神经系统中，单个神经元之间存在差异，因为神经细胞中存在一些独特的拷贝数变化。 这些神经元之间的异质性使得研究大脑回路是如何形成的和解决神经元重新连接的问题变得困难。 然而，单细胞测序技术可以在许多不同的时间研究神经细胞，并创建详细的单细胞图谱，以了解和识别大脑中不同类型的神经元及其连接分子。 Luo等人通过高通量单细胞甲基化测序区分小鼠和人额叶皮层神经元细胞的亚型。 他们在人类额叶皮层中发现了一组新的神经元，并根据神经元的甲基化组重新定义了神经元类型。 Lake等人使用一种新颖的单细胞测序方法绘制了大脑的第二代单细胞图谱。 已经确定了各种不同的神经元、神经胶质细胞亚型和细胞亚型，它们更容易受到不同脑部疾病的常见危险因素的影响。 有望了解神经系统疾病的发病机制。
神经发育和再生过程的应用
单细胞测序技术可以研究脑细胞的类型和发育过程中细胞之间的关系（图2）。 范博士等人利用单细胞测序技术鉴定了人类中期胚胎多个区域的多个细胞亚群，并分析了这些区域的基因表达和神经元成熟。 Zhong等人使用单细胞测序绘制了人类前额叶胚胎发育的单细胞转录谱。 从该图中，分析了人胚胎脑中前额叶细胞类型的多样性以及不同细胞类型之间的发育关系，进一步揭示了神经元产生和回路形成的分子调控机制。 研究关键细胞类型的功能并绘制完整的人脑细胞图谱非常重要。 Carter等人在小鼠小脑发育的单细胞测序图谱中确定了小脑细胞的主要亚群和有利于小脑发育的亚群。 这些研究将促进未来对小脑发育、神经生物学和疾病的研究。
在生殖和胚胎医学领域的应用。
单细胞测序技术能够在单细胞水平上对生殖细胞和胚胎细胞的整个基因组进行测序和定量（图2）。 这将有助于了解生殖细胞的发生以及生殖和遗传疾病的筛查、诊断和**。
五生殖细胞
陈博士等利用单细胞测序技术揭示了小鼠精子增殖过程中基因表达的动态过程和分子特征，以及选择性剪接的具体模式，发现了雄性生殖细胞发育特定阶段的关键调控因子。 同年，该团队对人类正常和异常细胞进行了单细胞RNA测序（scrna-seq）分析。 在此基础上，建立了精原细胞亚型、精母细胞亚型和精母细胞亚型的分层模型，进一步发现了人类生殖细胞的特异性标志物。 此外，还发现了NOA患者体细胞表达模式的变化**，这可能是NOA的发病机制。 上述研究为哺乳动物精子的发育成熟和配子的发育提供了有价值的数据**。 它还有助于了解男性不育症和此类疾病。
六生殖支持
单细胞测序技术可以检测出少量细胞的优势，可应用于产前诊断和辅助生殖。 单细胞测序检测雌性卵细胞、极性细胞或胚胎细胞，并选择健康的胚胎进行移植，可以降低患有先天性遗传病的新生儿的出生率，有助于预防遗传病。
胚胎细胞
在动物方面，单细胞转录组测序技术已被用于绘制斑马鱼和非洲蟑螂胚胎的细胞发育图谱，为理解发育生物学提供了重要线索。 李博士等人使用单细胞多序列测序绘制了植入前人类胚胎的全基因组图谱。 本研究对分析人类胚胎植入前发育中复杂且高度协调的表观遗传过程具有重要意义。 Vento-Tormo等人利用单细胞测序技术对妊娠早期胎盘细胞进行转录组分析，并绘制胎盘细胞图谱。 通过细胞图谱，鉴定了位于不同蜕膜层的血管周围细胞和基质细胞的三个亚群，以及蜕膜自然杀伤细胞DNK。 它还确定了可能最大限度地减少对有害母亲的免疫反应的调节反应，并揭示了有助于胎盘和生殖成功的相互作用。 这些发现对于了解早期妊娠过程以及改善妊娠相关疾病的诊断和改善具有重要意义。
七在免疫学领域的应用
免疫系统作为机体进行免疫应答和免疫功能的重要系统，在抵御外界病原体入侵方面发挥着重要作用。 许多在免疫系统中具有独特功能的免疫细胞是研究的重点。
自然杀伤细胞、DC细胞和淋巴细胞的应用
单细胞测序技术可以检测单个免疫细胞，以区分不同的免疫细胞群，并发现新的免疫细胞群及其关系（图2）。 这有助于了解复杂的免疫系统，并提出新的疾病靶点**。 Crinier等人通过单细胞RNA测序鉴定了小鼠和人类脾脏和血液NK细胞亚群，揭示了区分血液和脾脏NK细胞的两个不同特征。 通过转录组学比较，突出了NK1和NK2两个主要亚群在器官和物种上的相似性。 本研究提供了对NK细胞生物学的深入了解，并有助于将动物研究转化为人类相关研究。 Verani等人通过单细胞RNA-Seq鉴定了人类血液中DC细胞和单核细胞的多种亚型，并揭示了一种新的DC细胞亚群，该亚群具有浆细胞样特性，但能有效激活T细胞。 针对这一发现，其中一位研究人员建议“刺激这些细胞或潜在地增强身体的免疫系统以对抗癌症。 “这种细胞可能成为一种新的抗癌方法，它可以通过自身免疫系统消除肿瘤细胞，避免正常化疗药物对正常细胞造成的损害。 本研究重新定义了DC细胞之间的关系，有助于分析免疫系统的发育过程和功能，完成正常和疾病状态下的免疫监测。 Xin 等人使用单细胞 RNA 测序来研究持续感染期间的免疫细胞和细胞因子。 研究发现，表达IL-10的CD4 T细胞和产生IL-10的辅助细胞亚群的异质性在促进不同感染过程中的体液免疫中起着重要作用。
八免疫细胞异质性的原因
单细胞测序可以研究由病原体引起的高度异质性免疫细胞，准确检测个体免疫细胞的遗传物质，有助于了解机体复杂的免疫机制。 有趣的是，除了病原体外，衰老还会导致细胞异质性增加。 Martinez Jimenez等人对年轻和老年小鼠不同状态的CD4+ T细胞进行单细胞RNA测序，发现衰老影响细胞转录动力学，导致免疫细胞间基因表达异质性增加。 此外，免疫细胞无法产生异步反应，免疫性能减弱。 这项研究有助于解释随着年龄的增长，免疫系统的减弱。 这些都表明，细胞间转录变异的增加可能代表了细胞的衰老特征，为探索细胞衰老的机制奠定了基础。 最近，单细胞测序在炎症期的中枢神经系统免疫细胞中取得了新的发现。 Jordano等人发现，由于中枢神经系统中巨噬细胞亚群的自我更新、随机增殖和克隆扩增，髓样细胞亚群的特异性分化在神经炎症病理学的发展过程中是明显的。 此外，中枢神经系统巨噬细胞中的抗原呈递与神经炎症的病理作用无显著相关性。 研究表明，树突状细胞和单核细胞来源的细胞是实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 抗原呈递的主要参与者。 本研究绘制了中枢神经系统中髓样细胞亚群的动力学图谱，揭示了神经炎症过程中髓系细胞亚群特征分子的复杂变化，为改善EAE的**提供了理论依据。
根据上述研究，免疫细胞的异质性会影响机体的免疫状态。 免疫细胞异质性增加可能导致免疫细胞具有有助于对抗病原体入侵的特定功能。 它还会导致身体免疫力下降，这是组织老化的一个特征。 因此，对免疫细胞异质性的研究可以帮助人们了解机体复杂而微妙的免疫机制，并可能调整一些免疫机制来适应**某些疾病。
在消化和泌尿系统中的应用
Haber等人通过单细胞转录组测序发现了许多新的肠上皮细胞亚型，并绘制了肠上皮细胞的表达图谱。 从该图中，解释了肠道细胞维持体内平衡和对病原微生物做出反应的机制。 利用高精度单细胞转录组测序技术，分析了人类胚胎期的4个消化器官和成人大肠的多个细胞，揭示了人类4个消化器官发育过程中基因调控的相关机制（图2）。 王博士等人通过单细胞转录组测序证明了前体细胞在人胚胎阶段形成幼稚肾单位的异质性，以及前体细胞分化为肾小管上皮细胞过程中相应的转录调控事件和信号通路（图2）。 本研究还证明了先天性肾病候选致病基因的表达特征，有助于先天性肾病的发展。
在完成第一个基因组计划后，科学家们提出了一个人类细胞图谱计划，旨在完成37万亿个细胞的图谱绘制。 能够准确研究单个细胞的单细胞测序技术将是该项目的重要推动力。 单细胞测序技术绘制细胞图谱，帮助人们区分细胞类型并了解细胞间关系。 人们可以在单细胞水平上进一步了解生理过程和病理机制，以寻找新的诊断标志物或新的靶点。 这将为改善疾病的诊断和发展提供实践基础。
本文介绍了单细胞测序方法及其在肿瘤学、微生物学、神经系统、生殖医学和免疫学领域的应用，重点介绍了单细胞测序技术在高度异质性单细胞研究中的巨大优势。 然而，单细胞测序技术仍存在操作繁琐、检测成本高等问题，限制了该技术的推广。 希望单细胞测序技术能够更加简化和强大，进一步降低检测成本，使其能够应用于基础研究，在临床诊疗中发挥重要作用。
单细胞测序技术是揭示肿瘤遗传和功能异质性的重要工具，为癌症的克隆进化、微环境、耐药性和转移进展提供了独特的见解。 微流体是许多SCS技术和工作流程的关键组成部分，在吞吐量、可负担性和自动化方面具有优势。
SCS平台和工作流程的开发与基于微流体的技术齐头并进。 微流控技术在解决 SCS 低通量的挑战方面特别有用，但也提供了集成和自动化的潜力，以提高 SCS 的性能。