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蛋白激酶催化位点的高度保守性使得鉴定选择性ATP竞争性抑制剂成为一项具有挑战性的任务。 在粘附激酶 （FAK） 的开发过程中，偶然发现一类分子虽然对 FAK 无活性，但在抑制丝氨酸-精氨酸蛋白激酶 1-3 （SRPK1-3） 方面显示出活性和选择性。 选择性的关键在于这些分子与SRPK家族独特的非保守铰链区域的相互作用。 通过基于结构的药物化学研究，成功获得了SRPK抑制剂msc-1186。该分子在纳摩尔水平上表现出活性，并具有良好的选择性。 与CLK抑制剂联合使用，可以加速SR蛋白磷酸化的减少。 这篇文章是对的msc-1186详细梳理了设计策略和优化路线，为同类项目的结构优化提供了宝贵的经验。
图1msc-1186优化过程。
自 2001 年以来，FDA 批准了第一个激酶抑制剂伊马替尼 （imatinib，图2），蛋白激酶已成为主要的药物靶点。蛋白激酶通过将 ATP 的磷酸盐转移到底物蛋白的酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸来调节细胞功能。 研究蛋白激酶的关键致癌因素，如点突变激活、基因融合、脂质激酶扩增等，并在此基础上开发特异性激酶抑制剂。 目前已有70余种激酶药物在临床上获批，但其中许多缺乏选择性，因此限制了剂量，未能达到预期的靶向效果。 使用非选择性激酶抑制剂来阐明特异性激酶的生物学作用往往会产生相互矛盾的结果和模棱两可的结论。 因此，选择性激酶抑制剂的开发是临床前候选药物开发的关键挑战。
图2代表性激酶抑制剂。
粘附激酶（FAKs）属于非受体酪氨酸激酶家族，与癌细胞的生长、侵袭和转移密切相关。 目前已有6种FAK激酶抑制剂进入I期临床Ib临床研究。 pf-431396defactinib及其7-氮杂吲哚衍生物（图2）等FAK抑制剂，均存在选择性不足的问题。 与 FAK 相比，丝氨酸-精氨酸蛋白激酶 （SRPK） 在癌症中的作用尚未完全了解。 研究表明，SRPK在MyB、BRD4、MD24等关键蛋白的剪接中发挥重要作用，也参与VEGF的调控。 由于缺乏有效和选择性的SRPK抑制剂，SRPK在癌症剪接中的作用很难评估。 已经开发了几种可逆的SRPK抑制剂，例如：srpin340跟sphinx31（图3），但对CDK、MAPK、GSK和CLK等激酶家族也具有活性。 srpkin-1（图3）与SRPK蛋白酪氨酸的共价结合增强了选择性。
图3SRPK抑制剂的化学结构。
最近，默克公司（Merck & Co.）在JMC发表了一项关于选择性SRPK抑制剂的研究。 研究人员成功地将一类单齿FAK结构碎片转化为苯并咪唑-嘧啶骨架。 这种骨架结构包含“双受体铰链结合片段”，为高活性、激酶选择性和可逆的SRPK抑制剂奠定了基础。 设计和优化过程总结如下：
HIT发现
氨基嘧啶结构是一种常见的激酶铰链结合片段，能够形成供体-受体-供体型相互作用。 由于DFG序列前端存在大量疏水残基，因此针对狭窄后部口袋区域的结构设计可实现选择性，例如p38抑制剂skepinone-l（图2）是通过使用铰链区域内独特的甘氨酸翻转获得的选择性。 MET抑制剂clk-t3（图2）与蛋白质形成单齿铰链键是高选择性的关键。 减少与铰链区域的相互作用，同时与非铰链区域的其他保守区域结合已成为抑制剂开发的重要焦点。
为了找到FAK抑制剂，研究人员筛选了片段库。 发现片段与kd值为95 M，配体效率为0的蛋白质形成单齿铰链结合46。图4A的X射线晶体结构显示，吡啶上的N原子与Cys502形成氢键。 此外，吡啶上的 2-Ch 和 Cys502 上的 O 原子之间形成了非经典氢键。 通过放置片段含 7-氮杂吲哚进行叠加，并设计了n转移到邻位四唑的片段（图 4b）。
图4（a） 片段具有 fak 蛋白的晶体结构;（b） 碎片结构的起源。
选择转染FAK质粒的HEK293T活性进行生物活性检测。 片段跟EC50 分别为 301 m 和 253 m。 2-吡啶-苯并咪唑片段EC50 为 103 m（图 5）。 介绍了defactinib与DFG-loop相互作用的结构开，获取5a，但活动在很大程度上丧失了。 筛选化合物 5A 对 100 种激酶的活性，发现 SRPK1 和 SRPK2 的 IC50 分别为 448 nM 和 779μm。所以，对5a进一步的结构修改。
图5片段跟5a化学结构。
SAR研究
对咪唑环上的取代基进行了构效关系研究（表1），结果表明：
1）当提取电子基团时，如氟原子（5c）取代的SRPK1活性增加，氰基（5b）也是耐受的;
2）当提供电子基团时，如R6位置是甲基（5d），R5 位置为甲氧基 （5f）未优化SRPK1的活性;
3） R5 位置为卤素 （5g-5i），活性显著增加，并且5i对两种激酶均显示出显着的效力（SRPK1 IC50 = 32 nM 和 SRPK2 IC50 = 672 nM）。
4） 基于5i结构分析（如下所述）以进一步设计导数（5j-5m）。r4 是 F 原子 （5m），获得活性最强的SRPK12抑制剂;
5）R5位引入水溶性片段，如吗啉（5n）、N-甲基哌嗪（5o）和N-甲基吡唑（5p），可耐受 SRPK1 活性，但 SRPK2 活性降低。
5i显示了SRPK1和SRPK1的晶体结构（图6）。5iATP位点取向与经典嘧啶N原子受体和非经典CH供体氢键朝向铰链区域（SRPK1：LEU168和Glu166;SRPK2：Leu180 和 GLU178）;SRPK1（SRPK2）铰链区甘氨酸残基GLY169（GLY181）上的NH原子被翻转，与咪唑上的N原子形成氢键然而，leu168-gly169酰胺骨结构与其他抑制剂不同（图7）。
图6（a） 5i和SRPK1的晶体结构（PDB：7ZKS）;（b） 5i和srpk1的晶体结构。
Cl 和 F 原子与 srpk1 （srpk2） 的 his170 （his182）、tyr227 （tyr239） 和 leu231 （met243） 形成范德华效应（图 6）。 吡啶环的N原子通过水的介导与Glu217（SRPK1）和Glu229（SRPK2）形成氢键。 磺胺的O原子不仅与苯并咪唑上的N原子具有分子内氢键，而且通过水分子的介导，与srpk1（srpk2）的his171（his183）和gly169（gly181）形成氢键。
图7（a）5i蛋白质晶体的 LEU168 和 GLY169 残基与其他抑制剂叠加。
基于上述构效关系研究，得到了最有效的SRPK1 2衍生物5m。在 1 m 的浓度下，它在 395 面板上进行了测试5m激酶选择性（图8）。 将显示结果5mSRPK亚型和3的影响水平为>85%，IC50为27nm、81nm 和 06nm。50% <其他激酶 A。
图85m对 395 种激酶的选择性。
5mSRPK1的晶体结构表明其结合模式与5i相同（图 9）。 R4处的F原子插入Val223和Val167形成的疏水区，Val167和GLY168处形成范德华作用。
图9（a）5mSRPK1的共晶结构;（b） 图中显示了蛋白质结合表面。
自5h用于起始分子的进一步修饰（表2）。 将显示结果
1）苯并咪唑NH甲基化（化合物），然后不能与分子内磺胺类药物形成分子内氢键，导致SRPK1活性损失2倍，但SRPK2活性相同5h类似;
2）连接的NH被甲基化（化合物），活动不变;
3） 将嘧啶上的一个 n 原子变为 ch（），与5h与化合物相比对SRPK1的效力高出2倍，对SRPK2的效力更高，说明嘧啶的氢键没有预期的那么重要;
5）将苯并咪唑转化为吲哚结构（），失去 SRPKS 活性。构象分析揭示化合物吲哚 3 位 CH 原子位于铰链区域，失去与 LEU168 的氢键。
从结构分析（图6和图9）可以看出，SRPK1（SRPK2）中的PHE165（PHE177）、Val145（Val157）和ALA496（ALA540）形成亲脂性口袋。 基于此，对5h进行了进一步的修改（表3），结果显示：
1） 在嘧啶类化合物中）使SRPK1活性增加2倍，而SRPK2活性不受影响;
2） 放置化合物5hNH用嘧啶环（化合物），减少旋转度，增加活性;
3） 在化合物中关于甲基（化合物）的引入），深入口袋，但活性不增加;
4） 放置化合物嘧啶环变成吡啶（化合物），亲脂性增强（LOGP>5），SRPK1活性降低，但SRPK2活性增强。
理化性质和细胞活性
细胞活力
化合物5m最活跃和命名的msc-1186化合物对于阴性对照，命名为msc-5360。该测试使用 SRPK 活细胞结合测定法（Nanobret 靶向参与测定法）进行。msc-1186对于SRPK1和SRPK3细胞的活性，EC50测定分别为98nM和40nM（图10）。 由于SRPK1的nanobret实验不成功，因此在裂解的细胞中检测到它msc-1186EC50 为 149 nm。 通过ITC实验确定SPRK2的KD为145 nm。 测试了 135 种激酶的选择性。 5 米msc-1186对 MAPK14 的活性仅降低 36%，对测试的其他激酶没有显着影响。
图10（a）msc-1186对三种SRPK亚型的活性;（b） Nanobret 测定msc-1186对 135 种激酶的选择性。
物化性质
msc-1186它的溶解度低，容易被肝微粒体代谢（表4），因此它不适合动物研究，但目前还没有更好的选择性仪器分子的报道
与其他SRPK激酶抑制剂活性的比较（表5）。
srpin340它具有良好的选择性，但活性明显弱于msc-1186sphinx31它对SRPK1最有效，对SRPK2和SRPK3的作用较弱，并抑制CLK和DYRK等家族蛋白。 srpkin-1活性高效，但选择性低。
细胞功能特征
用于进一步验证msc-1186研究人员分析了细胞中磷酸化的PRSF4（PSRSF4）水平（图11）。 SRPK 抑制剂msc-118跟srpin340活动非常微弱。 然而，使用 CLK 激酶抑制剂t-025联合使用时，与单药治疗相比t-025，活性显著增强。
图11msc-1186msc-5360跟srpin340和CLK抑制剂t-025联合使用时对 PSRSF4 水平的影响。
为了进一步研究SRPK和CLK的协同作用，研究人员研究了该化合物对细胞内SR水平和HCT116位置的影响，HCT116具有高表达的泛磷酸化SR蛋白（PSR）（图12）。 低磷酸化的SR蛋白主要分布在核斑点中，而磷酸化的SR蛋白在细胞核中分布更均匀。 msc-1186它与 Pan-CLK 探针的阴性对照 （CLK-T3） 结合使用，而不会改变 PSR 水平或亚核定位活性。 具有 SRPK 阴性分子的有源 Pan-Clk 探针 （CLKT3）msc-5360以剂量依赖性方式降低PSR水平，并改变细胞核中PSR信号的分布（图12C）。 PSRSF4实验的结果相似msc-1186与CLK抑制剂CLKT3联合使用导致PSR水平降低（图12D），并且该组合进一步促进了PSR聚集。 这些结果表明，SRPK CLK抑制剂的组合不仅抑制SR4的磷酸化，而且影响SR蛋白的磷酸化和定位。
图12msc-1186CLK抑制剂单独或联合使用对PSR水平和亚细胞定位的影响。
结论
在优化 FAK 活动时，会偶然发现片段它具有 SRPK 活性。 首先进行吡啶异构化），然后转化为苯并咪唑（），将与Defactinib的磺胺基团结合，得到具有SRPK选择性的分子5aSAR优化产生了高效和高选择性的SRPK抑制剂msc-1186。开展了选择性SRPK和CLK抑制剂联合用药对剪接调控的研究，为药物组合提供了有利的选择。 msc-1186已提供给SGC联盟，用于更广泛的科学研究。
品**
doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01705
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