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小媛在之前的推文中介绍了“蛋白质翻译后修饰——泛素化”，并提到了泛素-蛋白酶体系统，知道这个系统可以降解蛋白质，那么除了可以降解蛋白质的系统之外，生物体内还有其他的蛋白质降解机制吗？答案当然是肯定的，这里就引出了小元今天要给大家介绍的话题——自噬。
自噬和泛素-蛋白酶体系统（UPS）是细胞内蛋白质降解的两种主要途径（图1）。 自噬，字面意思是“吃掉自己”，在细胞内细胞器和更稳定的蛋白质的降解中起着重要作用，而UPS负责大多数细胞内蛋白质的特异性降解，是一种具有广泛生物学作用的蛋白质高效降解途径。 此外，自噬参与许多重要的生理和病理过程，已成为近年来分子生物学发展最快的领域之一。
图1 真核细胞中蛋白质降解的两种降解系统（Luo等）。, 2010)。（a） 泛素-蛋白酶体系统;（b）自噬途径。 一部分细胞质，包括细胞器，被自噬分离器隔离，导致自噬体的形成。 自噬体的外膜最终与溶酶体融合以降解其内容物。
植物中的自噬途径自噬在真核细胞中普遍存在，是酵母和植物中的液泡或动物中的溶酶体降解蛋白质和细胞器以促进细胞内循环的重要过程（Marshall Richard S.）。 and vierstra richard d., 2018)。在正常的植物生长发育过程中，自噬水平通常较低，以确保体内平衡，但在环境胁迫下上调，从而帮助植物生存（Wang等）。, 2018)。植物中的自噬主要有三种类型：微自噬，巨自噬和巨自噬，其中巨自噬是研究最多的（Van Doorn和Papini，2013）。
在微自噬过程中，细胞质蛋白或整个细胞器聚集在液泡附近，并被液泡膜的内陷或突出所包裹，导致形成称为自噬体的囊泡内囊泡，其通过膜将蛋白质或细胞器释放到液泡腔中进行降解（Van Doorn和Papini，2013;marshall richard s. and vierstra richard d., 2018)。相反，在巨自噬中，在称为吞噬细胞的自噬体组装位点 （PAS） 上形成环状双膜结构。 一些研究表明，吞噬细胞起源于内质网、线粒体、质膜或内质网与线粒体接触的部位（Hamasaki等人）。, 2013；le et al., 2014；zhuang et al., 2017)。吞噬细胞伸长并包围细胞质物质，形成具有双膜结构的自噬体，随后与液泡融合并降解它们所包裹的内容物（Yimo Liu 和 Diane C.）。 bassham, 2012)。
图2 植物微自噬和巨自噬的形态学步骤（Marshall， Richard S.） and vierstra richard d., 2018)。
自噬的第三种途径，即超级自噬，目前仅在植物中发现，并且与程序性细胞死亡（PCD）同时发生。 与微自噬和巨自噬不同，超自噬将大分子成分从液泡转移到细胞质中，是导致细胞死亡的大规模降解的极端形式。
除了保守的微自噬和巨自噬途径外，酵母中还存在一种细胞质液泡靶向 （CVT） 途径，该途径是生物合成的，并将常驻水解酶的前体组成性地递送至液泡。 CVT通路的作用机制与巨自噬相似（Daniel J.）。 klionsky and scott d. emr, 2000)。在哺乳动物中，伴侣介导的自噬是第三种途径，它直接将底物蛋白转移到溶酶体中，而无需使用单独的囊泡（J fred dice, 2007)。目前，没有证据表明植物中存在CVT通路或伴侣介导的自噬。
自噬的选择性与非选择性尽管自噬长期以来一直被认为是细胞结构的非选择性降解过程（一般是自噬），但有大量证据表明，自噬也是一种高度选择性的机制，可以靶向大量冗余或受损的成分，作为细胞质量控制和应激反应的一部分（选择性自噬）（Yoshimoto和Ohsumi，2018）。 许多参与一般自噬的ATGS蛋白在酵母、植物和动物中是保守的，这表明真核生物中可能存在类似的自噬机制。 相比之下，选择性自噬途径依赖于多种选择性自噬受体。 尽管选择性自噬受体不保守，但它们的作用方式和调节机制在真核生物中是相似的（Farré和Subramani，2016）。 不同的自噬途径在植物发育和抗逆境胁迫中具有特定的作用，这里就不多介绍了。
自噬的过程和机制自噬体于 20 世纪 50 年代首次在哺乳动物细胞中观察到（de duve 等人）。，1955），但自噬的分子机制主要从酵母研究中揭示，然后慢慢扩展到动物和植物（Tsukada和Ohsumi，1993;ohsumi, 2001；marshall richard s. and vierstra richard d., 2018)。
植物中的微自噬和巨自噬都具有功能（Bassham等人）。, 2006)。这两种途径的机制与其他模式生物中描述的机制相似。
在植物微自噬中，目标物质直接被细胞膜的内陷吞噬。 含有目标物质的囊泡被挤压，释放到液泡中，并降解。 在植物发育过程中，微自噬参与储存蛋白、脂质和积累的淀粉颗粒的降解（van 等人）。, 1980；poxleitner et al., 2006)。
巨自噬，通常简称为自噬，自噬过程可分为不同的阶段：诱导、降解物质的识别、吞噬细胞形成、吞噬细胞扩张和闭合以及自噬体的融合和分解（masclaux-daubresse et al.）。, 2017)。自噬的具体过程如下图所示（图3）。
关于自噬的具体机制，这里就不赘述了，主要介绍一下与自噬相关的基因和蛋白质，具体如下：
3.1 ATG基因
使用酵母突变菌株鉴定了多个自噬相关基因（ATG基因），并且在动植物中鉴定了许多ATG同源物（Tang Jie和Bassham Diane C.）。, 2018)。目前，在拟南芥中已鉴定出约40种ATG，其中大多数与酵母ATG同源（Chung Taijoon，2019）。 ATG蛋白可分为4个核心官能团：1）ATG1 ATG13激酶复合物，在营养限制下启动自噬体的形成;2）自噬特异性III类磷脂酰肌醇（PI）3激酶复合物;3）促进吞噬体扩增的ATG9复合物;4） ATG8 ATG12 泛素样偶联系统，在吞噬细胞扩增和成熟过程中发挥作用（Kim 等人）, 2012；wang et al., 2018)。
3.2 tor
自噬是由各种刺激引起的雷帕霉素靶蛋白 （Tor） 复合物下调引发的，例如发育和营养信号传导 （Marshall， Richard S.）。 and vierstra richard d., 2018)。Tor 是一种必需的丝氨酸苏氨酸激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶家族，可负调控自噬（Díaz-Troya 等人）。, 2008)。
图3 自噬过程示意图（Mitou et al.）。, 2009)。自噬受TOR激酶调节。 抑制 TOR 激活组成型自噬，而 TOR 的过表达阻断自噬。 ATG13 和 ATG1 和 ATG11 结合形成活性复合物，触发自噬。 自噬体的形成包括膜递送、囊泡成核以及吞噬细胞的扩增和闭合。 ATG9 与 ATG2 和 ATG18 一起参与脂质向扩增吞噬细胞的递送。 VPS34脂质激酶复合物通过ATG8与PE（磷脂酰乙醇胺）的偶联产生PI3P修饰。 ATG8 首先通过 ATG4 裂解其 C 末端而成熟，然后通过 E2 样 ATG3 和 E3 样 ATG12-ATG5-ATG16 复合物与 PE 结合。 ATG8-PE定位于自噬体膜，用于吞噬细胞扩增。 选择性自噬是由ATG8通过AIM结构域与特异性自噬受体相互作用介导的。 不同的细胞成分可以被特定的自噬受体识别。 例如，C1蛋白从细胞核转移到细胞质，并通过与ATG8结合而降解。 整个叶绿体被 PUB4 泛素化并与 ATG8 结合。 叶绿体片段被 CHMO1 或 ATI12 识别，并被 RCBS 或 ATI12 修饰的质体降解。 在植物中，降解的过氧化物酶体可以被PEX6或PEX10识别，而泛素化的蛋白酶体可以被RPN10识别。 成熟的自噬体在FYVE和FYCO蛋白的帮助下被转运到液泡中，并与液泡融合以进行降解。
自噬研究技术可以使用各种技术和工具监测和评估自噬，以下是一些常用的技术。
4.1 电子显微镜
透射电子显微镜（TEM）是最早用于表征自噬的工具之一（Thomas Pashford and keith r.Porter，1962）是监测细胞和组织中自噬的最可靠方法之一，被称为监测自噬的“标准”。然而，TEM数据的解释需要特殊的专业知识，并且通常有几个标准可以准确描述自噬体和自噬溶酶体。 自噬体的特征在于其双膜或多膜结构，其中包含密度与细胞质相似的电子致密物质。 自噬溶酶体含有较深、降解或降解的物质，其中一些类似于溶酶体液泡。
4.2 分子标记物
参与自噬过程或被自噬特异性降解的蛋白质可用于监测自噬活性，ATG8 LC3荧光融合蛋白（例如GFP-ATG8 LC3）定位的变化通常用于检测细胞或转基因植物内的自噬。 此外，ATG6 3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）、ATG5 ATG16和ATG8也可用于检测植物的自噬。 此外，测量ATG1或ATG4活性也可用作监测植物自噬的工具。
4.3 溶酶体示踪剂
弱碱性胺选择性地积聚在低pH值的细胞区室中，可用于可视化酸性区室，如溶酶体液泡。 溶酶体示踪剂是一种荧光嗜酸探针，由与弱碱基相连的荧光团组成，可用于标记活细胞中的酸性细胞器，因为它在质子化后仍保留在这些细胞器的膜上。 溶酶体示踪剂必须与更特异性的自噬标志物联合使用，以区分自噬活性与增加溶酶体液泡活性的其他事件。
介绍一下自噬的研究技术，当然还有一些其他的方法，由于篇幅所限，这里就不多介绍了，感兴趣的小伙伴可以自行查阅相关资料！
文献实例以上简单介绍了一些关于植物蛋白自噬降解的背景知识，下面我们来看一个文献案例，看看在研究中遇到蛋白质降解时如何研究。
2024年6月，武汉大学何光存课题组在《自然**》杂志上发表了题为“A Tripartite Rheostat Controls Self-regulated Host plant Resistance to Insects”的研究，发现了第一个被植物抗虫蛋白识别和激活的昆虫效应子，揭示了BISP-BPH14-OSNBR1相互作用系统精细调节抗性-生长平衡的新机制， 为开发高产抗虫水稻品种提供了重要的理论和应用依据，也为研究其他粮食作物新的抗虫抗病机制提供了新的思路。
相关术语解释：
bphs：棕色飞虱。
bph14：从水稻中分离出由BPH14编码的第一个BPH抗BPH基因编码的蛋白质。
bisp：Bisp是BPH分泌的唾液蛋白，被BPH14直接识别。
bph14： RI35 品系（命名为 BPH14）是含有 BPH 抗性基因 BPH14 的重组自交系。
n14： Nippon Haru（原文中的N14）是典型的粳稻品种，含有BPH14的N14易感等位基因，与N14基因对应的蛋白质表示为N14蛋白。 在早期实验中使用N14建立了BISP-BPH14相互作用的原理。
mh63： Minghui 63 （MH63） 是 RI35 的 BPH 敏感亲本，是籼稻育种和基因组研究的模型品种。
bph14-bisp：以Bph14为受体材料，转基因材料转移至pubi：：bisp-myc。
mg132：26S蛋白酶体抑制剂。
在这项研究中，BISP被BPH14识别为一种昆虫效应子，并激活了褐飞虱在饲喂含BPH14的水稻过程中的抗虫反应。 植物抗性的不断激活往往会对生长发育产生不利影响，因此水稻需要根据其正常的生长发育情况，对自身的抗虫性反应进行微调。 那么，如何平衡两者之间的关系呢？作者发现BPH14对BiSP的识别可以激活抗虫反应，并且BPH14也严格控制BISP的蛋白水平，从而兼顾其自身的生长和抗虫反应。
第一个证明bph14可降解bisp
BPH14植株中BISP异位表达的适应性成本表明，在水稻自然生长环境中，BPH14介导的抗性激活应受到严格控制。 有几条证据支持这一假设。 首先，当BISP和BPH14在水稻原生质体中共表达时，BISP水平较低（图4A），BISP水平与BPH14水平呈负相关（图5A）。 当BISP与N14共表达时，BISP水平没有降低，这表明BISP-BPH14相互作用的特异性（图4A）。 这些结果表明，BISP以BPH14依赖性方式降解。
然后证明bph14由自噬介导bsip退化
如前所述，泛素-蛋白酶体系统和自噬是植物细胞中主要的蛋白质降解途径。 泛素-蛋白酶体系统是控制植物对病原体免疫反应的关键翻译后机制（Wersch 等人）。, 2020)。为了验证泛素-蛋白酶体系统是否参与 BISP-BPH14 免疫激活的调节，作者在表达 BISP 和 BPH14 的原生质体中添加了 26S 蛋白酶体抑制剂 MG132。 Mg132阻断WRKY72蛋白酶体途径的降解（图5B），但不抑制BISP的降解（图4B）。 相比之下，可以使用四种自噬抑制剂阻断BISP的降解（图4C），这表明自噬途径参与了BISP的降解。
图4 BPH14依赖性BISP降解（Guo等人）。, 2023)。（a） BPH14和N14对水稻原生质体BISP水平的影响;（b） 26S蛋白酶体抑制剂MG132对水稻原生质体BISP水平的影响;（c） 自噬抑制剂对水稻原生质体BISP蛋白水平的影响。 3-MA：3-甲基腺嘌呤，CQ：氯喹，E-64D：阿洛司他汀，LQ：亮扑物。 所有抑制剂均用DMSO作为溶剂溶解。
图5 （a） BPH14对水稻原生质体BISP含量的影响。 Bisp-Myc 在水稻原生质体中单独表达或与 BPH14-Myc 共表达。 抗Myc抗体和抗肌动蛋白抗体分别检测总蛋白。 （b）Western blotting结果显示，Mg132处理阻断了WRKY72-HA的蛋白酶体降解。 原生质体总蛋白分别用抗HA抗体和抗肌动蛋白抗体检测。 （c）免疫印迹分析显示，自噬抑制剂可以阻断HD1-HA的自噬降解。 原生质体总蛋白分别用抗HA抗体和抗肌动蛋白抗体检测（Guo等人）。, 2023)。
知识补充：表1 植物自噬研究中常用的抑制剂和激活剂（Marshall Richard S and vierstra richard d., 2018)。
为了进一步评估自噬在BISP降解中的作用，作者使用青色荧光蛋白标记的ATG8F（CFP-ATG8F）作为监测自噬的标志物（Han等人）。, 2015；klionsky et al.Anderson 等人，2021 年）（图 6a、b）。当CFP-ATG8F与BISP或BPH14在烟叶中共表达时，几乎不可能检测到与自噬前体和自噬体相对应的点状CFP结构。 然而，当CFP-ATG8F与BISP和BPH14共表达时，点状CFP结构的数量显著增加，表明BISP和BPH14共表达诱导自噬。 这种相互作用是特异性的，因为CFP-ATG8F与BISP和N14的共表达不会增加自噬体的数量。 刀豆霉素A（Cona）可以阻断自噬通量（Klionsky等人）。Anderson等人，2021），在共表达BISP和BPH14的Cona处理的细胞中，自噬体的数量显着增加。当核心自噬基因NBATG6、NBPI3K和NBAG7沉默时，共表达CFP-ATG8F和BPH14的烟叶中的自噬体数量显著减少（图7a、b、c）。
图 6 （A）（上）CFP-ATG8F 标记的自噬点结构在不存在（顶部）或存在（底部）CONA 时的共聚焦图像。 结果表明，烟叶农杆菌侵染后，CFP-ATG8F与BISP、N14或BPH14共表达，CFP-ATG8F和BISP与N14或BPH14共表达，细胞中自噬体共表达。 红色箭头表示 cfp-atg8f 标记的自噬位点。 （下图）显示了扩大的自噬体的图像;（b） 存在或不存在 CONA 时 CFP-NBATG8 标记的自噬位点的平均数量（Guo 等人）。, 2023)。
图7 沉默NBATg6、NBPi3K或NBATg7抑制CFP-ATG8F标记的自噬位点的产生（Guo等）。, 2023)。（A） CFP-ATG8F标记的自噬点结构与BISP-YFP共定位的共聚焦图像。 CFP-ATG8F、Bisp-YFP 和 BPH14 在沉默叶片 （Vigs-NBAT6、VIGS-NBIPI3K 和 VIGS-NBAtG7） 或非沉默对照叶片 （VIGS-EV） 中瞬时共表达。 红色箭头表示 CFP-ATG8F 标记的自噬位点与 BISP-YFP 共定位。 （下图）显示了扩大的自噬体的图像;（b） 半定量RT-PCR检测NBATG6、NBPI3K和NBAT7的转录水平。 NBACTB 转录水平作为对照;（c） 沉默和对照叶片中CFP-NBATG8标记的自噬位点的平均数量。
此外，通过透射电子显微镜，与BPH14和MH63植物相比，作者在未感染的BPH14-BISP植物的韧皮部伴侣细胞中观察到更多的双膜自噬体结构（图8A，B）。 因此，未感染的BPH14-BISP植株的OsatG8蛋白和OsatG8A、OsatG8b和Osatg8c转录本显著高于BPH14和MH63植株。 这些观察结果表明，BISPs以BPH14依赖性方式降解。
图8（a）未感染的BPH14-BISP植物韧皮部自噬结构的透射电子显微镜图像。插图显示了放大后的自噬体图像。 红色箭头表示双膜自噬体的位置;（b）双膜自噬体的定量（Guo等人）。, 2023)。
终于在bph易感（mh63） 与反bphbph14） 在植物中bisp蛋白质水平，指示bisp蛋白质水平受到严格控制。
由于BPHS在饲喂时会将含有BISP的唾液分泌到水稻组织中（图9A，B），因此作者监测了受感染的BPH易感（MH63）或BPH抗性（BPH14）植物的BISP水平。 在MH63植物中，BISP在6 h时首次检测到，并在BPH喂养72 h后继续增加（图10）。 相比之下，BPH14植物的BISP水平较低，在饲喂24小时后保持不变（图10）。 BPH感染感感植株OSATG8蛋白水平无显著变化。 相反，在BPH14植物中，OSATG8蛋白水平在饲喂6小时后增加，并在72小时时保持在较高水平（图10）。 这些结果表明，自噬在 BPH14 中被激活，但在 MH63 中未被激活。 这些数据与BPH感染后BPH14植株和MH63植株中3个OSATG8基因的上调密切相关。 Cona处理显著提高了BPH14感染植株中ATG8蛋白的水平。 这些结果表明，BPH喂养激活了自噬，BISP水平受到严格控制。
图9（A）BPH感染过程中BISPs被转运到水稻叶鞘中。 叶叶素用抗BISP抗体进行分析。 Ponceau S 染色作为上样对照;（B）免疫组化染色显示BPH感染水稻叶鞘中的BISP。 用抗BISP抗体检测未感染（中）和感染的BPH（下）鞘，采用免疫前兔血清检测作为阴性对照（Guo等）。, 2023)。
图10 BPH14和MH63植株中BISP、OSATG8和OSNBR1的免疫印迹检测（Guo等）。, 2023)。
原研内容很多，小元在这里就不一一解读了，只挑出与蛋白质自噬降解相关的相关实验给大家介绍一下，原文中还有更深入的机理研究，有兴趣的可以自己阅读！
小媛喋喋不休
前期我介绍了泛素-蛋白酶体系统，今天讲解了自噬降解途径，此后小元给大家介绍了蛋白质降解的两种主要途径，希望不懂的人好好学习！另外，通过小媛的讲解，可以再次证明，一篇文章中一个小小的实验背后隐藏着那么多的背景知识，如果你不了解这些背景知识，你可能无法理解别人发表的文章，所以在打开一个新的研究领域时，一定要学习这个领域的基本知识
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