1. 单克隆来源的方法学验证
一轮限制稀释或单细胞电镀设备与单克隆成像设备。 与概率计算和统计不同，该方法可以提供单克隆来源的图像数据，但同时也面临一定的挑战。 有必要考虑细胞是否粘附，它们是否沉入底部，以及细胞在坠落后的位置。 成像设备的孔位对准、微孔板的底焦点、光源、透镜位移、分辨率、边缘效应等，都会影响图像的准确性和有效性。
单克隆起源方法的验证可以围绕以下几个方面进行：
1.验证自然细胞沉降过程。
采用明场成像方法研究了平台过程的细胞在平台沉积时间内是否能够沉降，以及不同时间点的沉降效果。
2、离心沉降工艺验证。
采用明场成像研究了平台离心条件下平台过程的细胞是否能沉降，以及离心后不同时间点的沉降效果。
3.细胞鉴定验证。
采用明场和荧光成像技术考察成像设备对单克隆抗体的识别能力。
4、单克隆电镀设备项目交叉验证。
采用明场和荧光成像方法，研究不同项目间单克隆电镀设备是否存在细胞系交叉。
有必要用单细胞电镀设备和成像设备验证单细胞电镀设备和成像设备的单克隆起源。 考察了单细胞电镀设备对单细胞的分辨能力和分选效率，并通过验证的细胞沉降方法对单克隆成像设备进行细胞鉴定和交叉验证。 同时，验证和提高了单细胞铺板和成像设备作为单克隆来源的单细胞分选方法的可信度。
基因泰克使用单细胞打印与平板成像相结合的单细胞分选方法来验证其分选效率和单克隆来源的可信度。 从单细胞电镀装置的分选图像可以看出，有95个9% 单细胞孔，26% 空细胞孔，15%的多细胞孔，由于图像对比度低，细胞落入ROI（感兴趣区域）外环区域，或软件无法识别贴壁细胞，导致假阳性孔。
使用成像设备对按绿色和红色荧光混合群体分类的细胞进行拍照和跟踪，该设备能够识别 879%的单细胞孔，培养14 d后，9孔为红绿混合细胞群，03%假阳性单克隆率。 因此，系统验证单细胞平台分选方法的单克隆来源可以有效提高实验的可靠性，并为单克隆来源的验证提供足够的数据，对在整个药物开发过程中提供良好的细胞系单克隆性起着重要作用。
2024年，FDA审稿人对细胞系的单克隆来源进行了一些观察：单克隆来源验证是为了减少细胞库的异质性，保持生产过程的一致性和可预测性，确保最终产品的产量和质量在预设范围内。 如果存在影响产品质量的单克隆来源的重大缺陷和风险，则需要对单克隆来源的控制策略进行研究，作为整体控制策略的一部分。 单克隆来源的验证主要是评估最终产品的安全性和有效性，以及单克隆来源不等于细胞系遗传同质性的观点。 进一步指出，单克隆来源对产品的质量和安全起着非常重要的作用。
2. 单克隆起源中概率和保证概念的区别
概率：以数学方式计算单克隆的概率（例如，泊松分布）。 保证：评估单克隆起源所需的信息，包括概率计算、补充文件和数据。
一般来说，以下单克隆起源情况是可以接受的：高概率、低概率+高把握、低概率+少把握+充分的控制评价策略。
3. 分析方法辅以单克隆原产地保证证据
独特的遗传特征（质粒整合位点、质粒重排等）是独一无二的，通常不受CHO细胞可塑性的影响，可以作为单克隆起源的证据。 通常有几种方法可用于分析质粒整合位点：
01. 荧光原位杂交技术（FISH）：在染色体水平上观察整合位点，无需获取整合位点序列，直接目视检测DNA在染色体上的位置和均匀性。 此外，原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响，已成为重复序列和多基因家族定位的重要手段。 然而，它容易受到染色体重排的影响，并且对低拷贝位点具有很高的敏感性。
02.Southern印迹：KB级DNA检测水平，其产生的条带对每个整合位点都是唯一的，无需获取整合位点序列，不易受到染色体重排的影响。 但工作量大，分辨率不高，会受到集成站点附着顺序重新排列的影响。
03. 连接PCR：BP级DNA检测水平，通过NGS或传统方法（Inverse PCR、SPLINKERETTE-PCR或LAM-PCR）获得基因整合位点的关键序列，然后通过连接PCR扩增关键序列，以确定是否存在独特的整合位点。 这种方法不易发生突变和重排，但需要亚克隆并获得整合位点的序列。
04. 二代测序技术（NGS）：该方法可直接用于整合位点单克隆来源的鉴定，不一定需要大量的亚克隆，但操作和分析繁琐耗时，可能会遗漏一些位点。
四、单克隆来源的控制策略（CS）
非单克隆细胞系的控制策略取决于产品及其应用。 一些常规的控制策略包括但不限于额外的检测方法，例如用于检测序列变异性、糖基化水平等的LC-MS;超越有限数量的体外细胞传代的全面系统评估;添加更多关键工艺参数;过程控制趋势统计;重要原材料变更的风险评估;对新建立的细胞库等进行严格控制和全面识别。
5. 总结
单克隆来源是生物制药生产过程中整体控制策略的一部分，对产品的安全性和有效性起着至关重要的作用。 单克隆来源验证旨在减少细胞库的异质性，确保生产过程的一致性和可预测性，并确保最终产品的产量和质量在预设范围内。 建议从细胞株筛选阶段开始尽快做好单克隆性工作，以降低后续药物开发的风险。
引用：
1. achieving greater efficiency and higher confidence in single-cell cloning by combining cell printing and plate imaging technologies. biotechnology progress, (doi:10.1002/btpr.2698
2. considering “clonality”: a regulatory perspective on the importance of the clonal derivation of mammalian cell banks in biopharmaceutical development.