分子筛排阻色谱(凝胶过滤)。它是一种根据生物分子的大小和形状分离物质的层析方法,凝胶过滤介质是多孔网络结构,当样品流过填料时,组分之间存在分子量差异,较大的分子首先流出色谱柱,分子量越小, 生物分子进入培养基越深,因此在培养基中的停留时间越长。
1.凝胶过滤色谱的特点
非吸附色谱法,分离度不受实验条件的影响。
易于使用,只需要一个缓冲液。
2.博格龙凝胶过滤层析树脂的种类及其各自特点
(1)Borgron BESTDEX系列:葡聚糖凝胶
Bestdex G系列,常用于蛋白质、多糖、核酸等生物样品的脱盐和缓冲液置换,也可用于多肽、寡核苷酸、天然产物、化学药物的分离纯化。
·bestdex lh-20在BestdexG-25F的基础上用羟丙基改性,引入羟丙基后介质同时具有亲水性和亲油性,可采用有机溶剂作为流动相,适用于天然产物的分离纯化和化学药物的精细纯化。
(2)Borgron bestarose系列:琼脂糖凝胶
·bestorse 4b/6b由4%和6%琼脂糖分别经乳化、冲洗、筛分制成的凝胶过滤介质,非特异性吸附性低,基质柔软,分离范围广,适用于分子量差异大、分离度要求低的样品,适用于多糖等生物大分子的分离、纯化或检测, 核酸和病毒。
·bestorsecl-4b/cl-6b在贝达罗斯4B 6B的基础上与双功能交联剂2,3-二溴丙醇交联,分离范围相同,理化性能与贝达罗斯4B 6B相比有明显改善,适用于有机溶剂的分离,可承受强力原位清洗和121高压灭菌。
·bestorse ff在贝达罗斯4B 6B凝胶的基础上与双功能交联剂进行交联,交联度高于贝达罗斯CL-4B Cl-6B,理化性质更稳定,该类培养基可承受121°C高压灭菌,流速快,适用于大规模分离纯化。
(3)Borglon Chromdex系列:以高交联琼脂糖为骨架,交联葡聚糖为填充物
粒径为34μm,是分辨率和选择性最高的凝胶过滤树脂,硬度高,流速快,理化性能稳定,非特异性吸附低,是精细纯化阶段的良好选择。
3.凝胶过滤层析填料的应用范围
(1)分组分离
对于大分子样品和离子的分离,样品体积可达柱体积的30%,可用于脱盐和置换缓冲液。
(2)精细分离
分析纯化:样品的分析纯化应达到分析纯度,用量小,色谱柱柱高15 30cm,装样体积为03%~0.5% 以确保高分辨率,同时节省时间和缓冲。
样品制备:应用于去除不同分子量的聚集体和分离蛋白质,柱高应高于60cm,上样体积应为0在5%到4%之间。
(3)分子量的测定
通过测定标准蛋白的相对分子量与其在凝胶过滤色谱介质中的保留时间之间的关系来确定未知分子的相对分子量。
由于每种介质的孔径都有一定的范围,因此选择凝胶滤料的关键是选择合适的分离范围,当分子量在填料的分离间隔内且组分分子量增加一倍以上时,可以保证良好的分离效果。